柚子皮黑曲霉的分离鉴定及产酶特性研究

张超凤, 汪雨晨, 陈卫平, 张凤英

(江西农业大学 食品科学与工程学院，江西 南昌 334450)

柚子皮黑曲霉的分离鉴定及产酶特性研究

张超凤, 汪雨晨, 陈卫平, 张凤英*

(江西农业大学 食品科学与工程学院，江西 南昌 334450)

对柚子皮上自然生长的黑曲霉进行分离鉴定，并探讨其产酶特性。以平板稀释法从柚子皮上分离出一株霉菌菌株，通过观察其形态特征和培养特征，对照《真菌鉴定手册》判定该菌株的种属；采用鉴定培养基法对其产酶特性进行分析。根据柚子皮的成分特性，以干柚子皮为主要原料，该菌为生产菌株，采用固态发酵法探究培养基的成分、柚子皮含量、培养基初始含水量及发酵时间4个因素对纤维素酶活力的影响。结果表明，该菌株为黑曲霉(Aspergillusnige)，可产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶；固态发酵培养基中添加柚子皮12 g，麸皮0.5 g和(NH4)2SO40.5 g，培养基初始含水量保持在68.5 mL/100 g，培养时间控制在60 h左右时纤维素酶产量较高。

柚子皮；黑曲霉；固态发酵；纤维素酶

黑曲霉(Aspergillusnige)属半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、丛梗孢科，是一种常见的繁殖能力较强的真菌，且又是不产生毒素的安全菌种，因而被人类长期利用[1]。黑曲霉对营养要求不高，在含有碳源、氮源及微量元素的培养基中就能生长。黑曲霉可产生许多酶类，包括α-淀粉酶、纤维素酶、过氧化氢酶、果胶酶、糖化酶和蛋白酶等，是常用的工业酶制剂生产菌株[2]。由于其生产的酶制剂具有安全性好、应用范围广的特点而越来越受到人们的重视[3]。黑曲霉是纤维素酶产量最高的菌株之一[4]，纤维素酶不仅在一些传统行业具有应用价值，而且在纺织、造纸、单细胞发酵和环保等新兴领域具有巨大的市场潜力[5]。 纤维素酶的生产方式分为液体发酵和固态发酵两种，固态发酵具有成本低廉、工艺简单的优点，因此被国内大部分厂家所采用[6]。 黑曲霉在土壤、水果、粮食等植物原料或产品中广泛存在，在腐烂的柚子皮上也会大量生长。柚子作为我国主要水果之一，在南方地区大面积种植，柚子皮占到全重的54%～55%。我国对柚子皮的利用率很低，每年都有很多柚子皮被当做废弃物扔掉，造成资源浪费[7]。柚子皮含有多种营养成分，适合微生物的生长，白色絮状层含有大量的纤维素[8]。目前，工业上利用真菌生产纤维素酶的固态发酵基料主要为麦麸、稻壳、秸秆等，利用柚子皮为原料固态发酵产酶的研究较少。 因此本研究试图从柚子皮上自然生长的霉菌中分离出适合用柚子皮固态发酵法产纤维素酶的菌株，以期为柚子皮的综合利用开辟新途径，也为真菌工业化固态发酵柚子皮提取纤维素酶提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 柚子皮 福建琯溪蜜柚皮，购自江西农业大学校园水果店。

1.1.2 培养基 PDA培养基；酪素培养基：参照文献[9]；刚果红培养基：参照文献[10]；果胶琼脂培养基：参照文献[11]；固态发酵培养基：烘干碾碎的柚子皮适量，麸皮0.5 g、(NH4)2SO40.5 g、水适量，pH自然。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分离纯化 将柚子皮置阴凉处，待出现明显黑色霉菌后，采用平板划线法分离出单菌落,再使用孢子悬液平板稀释法纯化菌株，将其接种至斜面培养基上，30 ℃培养48 h，于4 ℃冰箱中备用

1.2.2 菌种鉴定 ①菌落特征观察：挑取上述6支少量斜面菌体点接于PDA培养基，30 ℃培养24～72 h，观察菌落特征与生长变化；②菌体特征观察：采用载片培养法，在显微镜下观察菌体的特征结构，并用显微测微尺测量菌体各部分结构的大小。

1.2.3 菌株产酶鉴定 ①产淀粉酶鉴定：从斜面挑取少量菌体点接于PDA培养基，30 ℃培养72 h，在培养基内滴加适量碘液，观察菌落周围是否有淀粉分解圈产生；②产蛋白酶鉴定：从斜面挑取少量菌体点接于酪素培养基，30 ℃培养72 h，观察菌落周围是否有水解圈产生；③产纤维素酶鉴定：从斜面挑取少量菌体点接于刚果红培养基，30 ℃培养72 h，观察菌落周围是否有水解圈产生；④产果胶酶鉴定：从斜面挑取少量菌体点接于果胶琼脂培养基，30 ℃培养72 h，在培养基内滴加适量1 mg/mL刚果红染液染色40 min，用蒸馏水洗涤2～3次除去溶液，再用蒸馏水脱色10 min后观察菌落周围是否有透明圈产生。

1.2.4 菌株分解柚子皮能力的粗测定 采用直接干燥法[12]测得柚子皮的含水量为81.87%，取3 g烘干至恒重的柚子皮放入培养皿中，按计算的失水率补充水分使其恢复至失水前的状态，并接种3 mL菌悬液，将培养皿放入30 ℃培养箱中培养4 d左右，将长满黑色孢子的柚子皮取出，用清水将表面的孢子洗净，并放入56 ℃烘箱内烘干至恒重后称重。黑曲霉对柚子皮的分解率(%)=((分解前烘干柚子皮的质量-分解后烘干柚子皮的质量)/分解前干柚子皮的质量)×100%。同样的方法做5组平行实验，并用显微镜观察柚子皮被分解前后的显微结构。

1.2.5 孢子悬浮液制备 选取产纤维素酶能力较强的菌株，加入10 mL无菌水，用接种针将斜面上的孢子轻刮至装有玻璃珠的小锥形瓶中，充分摇匀，并加无菌水调整为所需要的孢子浓度，制成孢子悬浮液。

1.2.6 固态发酵产纤维素酶的探讨 ①培养基组成对产纤维素酶的影响:在250 mL锥形瓶中分别装入10 g柚子皮、10 g柚子皮+0.5 g麸皮、10 g柚子皮+0.5 g (NH4)2SO4和10 g柚子皮+0.5 g麸皮+0.5 g (NH4)2SO4，用玻璃棒搅拌均匀，灭菌冷却后加入8 mL无菌水，接入15%孢子悬浮液，摇匀打散，28 ℃恒温培养60 h(培养期间摇晃4～5次)，提取粗酶液，检测比较纤维素酶活；②柚子皮含量对产纤维素酶的影响:在250 mL锥形瓶中分别装入6、8、10、12、14 g碾碎的柚子皮及0.5 g麸皮、0.5 g (NH4)2SO4，制成固态发酵培养基，用玻璃棒搅拌均匀，灭菌冷却后加入8 mL无菌水，接入15%孢子悬浮液，摇匀打散，28 ℃恒温培养60 h(培养期间摇晃4～5次)，提取粗酶液，检测比较纤维素酶活；③培养基含水量对产纤维素酶的影响:在250 mL锥形瓶中装入适量柚子皮，0.5 g麸皮和0.5 g (NH4)2SO4，用玻璃棒搅拌均匀，灭菌冷却后加入无菌水3、5、8、10 mL，使对应培养基的含水量分别为34.2、47.9、68.5、82.2 mL/100 g，接入15%孢子悬浮液，28 ℃恒温培养60 h(培养期间摇晃4～5次)，提取粗酶液，检测比较纤维素酶活；④发酵时间对产纤维素酶的影响:在250 mL锥形瓶中装入12 g柚子皮，0.5 g麸皮和0.5 g(NH4)2SO4，用玻璃棒搅拌均匀，灭菌冷却后加入8 mL无菌水，接入15%孢子悬浮液，摇匀打散，28 ℃恒温分别培养24、48、60、72、90 h(培养期间摇晃4～5次)，提取粗酶液，检测比较纤维素酶活。

1.2.7 粗酶液的提取 取5 g发酵固体于锥形瓶中，加入50 mL蒸馏水，适当搅拌后在40 ℃恒温水浴锅中浸提1 h。用滤纸过滤，滤液即为粗酶液[13]。

1.2.8 发酵因素对菌株产纤维素酶的影响 采用牛津杯法取100 μL粗酶液至牛津杯内，37 ℃培养12～14 h，观察透明圈的大小，比较各发酵因素对菌株产纤维素酶的影响。

2 结果与分析

2.1 分离菌株的菌落特征

纯化菌株在PDA培养基上30 ℃培养24～72 h后，菌落生长良好。菌落表面凸起，边缘粗糙。菌落初为白色，呈棉絮状，菌丝致密无褶皱，后长出黑色孢子。

2.2 菌体特征观察

将纯化菌株30 ℃载片培养3 d后，据菌体大小情况用4倍、10倍或40倍的显微镜进行观察，可以清楚地观察到菌丝、孢子穗、分生孢子等结构，并用显微测微尺测量菌丝、孢子穗、分生孢子等。通过对菌落形态及特征结构的观察，未发现其存在有性生殖过程和产子囊结构，属于无性生殖。参照《真菌鉴定手册》及其群体和个体形态观察，确定该菌株为半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，曲霉属，黑曲霉种属。见表1及图1、图2。

表1 菌体形态特征

图1 目的菌株菌丝Fig.1 Culture results of purpose strains

图2 目的菌株孢子Fig.2 Mycelium of purpose strains

2.3 菌株产酶鉴定

由图3可知，在4种鉴定培养基上的菌落四周均出现了较明显的透明圈或水解圈，说明该分离菌株可产生淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶以及果胶酶，符合黑曲霉的产酶特性，进一步证实该菌株为黑曲霉。

2.4 菌株分解柚子皮能力的粗测定

由表2可知，黑曲霉对柚子皮的分解率约为73.33%，分解能力较强，利用率高，通过分解前后柚子皮显微结构对比(图4、5)，发现致密的纤维结构明显变得松散，故可将柚子皮作为黑曲霉固态发酵产纤维素酶基质的主要成分。

图3 菌株产酶特征Fig.3 The characteristics of enzyme production by strains 1：产淀粉酶特征；2：产蛋白酶特征；3：产纤维素酶特征；4：产果胶酶特征1：Characteristics of amylase production；2：Characteristics of protease production；3：Characteristics of cellulase production；4：Characteristics of pectinase production

试验编号分解能力 分解前/g 分解后/g 分解率/%13.000.7674.6723.000.7973.6733.000.8272.5743.000.8472.0053.000.7973.67

图4 分解前柚子皮的显微结构Fig.4 The microstructure before decomposition

图5 分解后柚子皮的显微结构Fig.5 The microstructure before decomposition

2.5 固态发酵各因素对产纤维素酶的影响

2.5.1 培养基组成对产纤维素酶的影响 通过测定牛津杯周围透明圈大小可知(图6)，当培养基中只含有柚子皮时，产生的纤维素酶较少。当加入麸皮或(NH4)2SO4后，纤维素酶产生量均有所增加。当在柚子皮中同时加入麸皮和(NH4)2SO4后，纤维素产生量有明显增加，说明仅用柚子皮作为固态培养基成分生产纤维素酶的营养素还不够，在培养基中适当增加碳、氮源和生长因子更有利于纤维素酶的代谢积累。

图6 培养基组成对产酶的影响Fig.6 Effect of medium composition on enzyme production1：柚子皮；2：柚子皮+麸皮；3：柚子皮+(NH4)2SO4；4：柚子皮+麸皮+(NH4)2SO41：pomelo peel；2：pomelo peel+wheat bran；3：pomelo peel+ammonium sulphate；4：peel+wheat bran+ammonium sulphate

2.5.2 柚子皮含量对产纤维素酶的影响 通过测定牛津杯周围透明圈大小可知(图7)，随着固态发酵培养基中柚子皮含量的增加，透明圈逐渐增大，说明柚子皮中丰富的纤维素和其他营养成分可供菌株利用和诱导产酶，当柚子皮含量为12 g时，纤维素酶活力最高，当柚子皮含量增加到14 g时，纤维素酶活力下降，其可能原因是在一定容量发酵器皿中柚子皮过多使得培养基的通气量变差，其他营养素比例下降，影响产酶效果。

图7 柚子皮含量对产酶的影响Fig.7 Effect of pomelo peel content on enzyme production1：柚子皮含量为6 g；2：柚子皮含量为8 g；3：柚子皮含量为10 g；4：柚子皮含量为12 g；5：柚子皮含量为14 g1：pomelo peel content is 6 g; 2： pomelo peel content is 8 g; 3：pomelo peel content is 10 g; 4：pomelo peel content is 12 g; 5：pomelo peel content is 14 g

2.5.3 培养基含水量对产纤维素酶的影响 通过测定牛津杯周围透明圈大小可知(图8)，当培养基含水量为68.5 mL/100 g时，透明圈直径最大，说明产纤维素酶较多。培养基含水量较低时会影响菌株的生长和产酶，而培养基含水量过高时，基质的黏度增大，容易结块，透气性变差，供氧不足，从而影响产酶。因此，培养基含水量在68.5 mL/100 g左右时较为适宜。

2.5.4 发酵时间对产纤维素酶的影响 通过测定牛津杯周围透明圈大小可知(图9)，发酵0～24 h，菌株生长缓慢，培养基表面只有少量的菌丝生成，未产生黑色孢子，此时产生的纤维素酶较少；培养至48 h，培养基中有少量黑色孢子生成，纤维素酶开始大量合成；发酵60 h，透明圈最大；发酵72 h，培养基布满黑色孢子，但透明圈没有变大；超过90 h，透明圈开始变小，可能是菌体代谢产物积累和培养基纤维素的消耗造成的。60～72 h之间虽然透明圈变化不大，但由于72 h时黑色孢子太多不利于粗酶液的提取，因此选取60 h较为合适。

图8 培养基含水量对产酶的影响Fig.8 Effect of water content on cellulase production1：34.2 mL/100 g；2：47.9 mL/100 g；3：68.5 mL/100 g；4：82.2 mL/100 g

图9 发酵时间对产酶的影响Fig.9 Effect of fermentation time on cellulase production1：发酵24 h；2：发酵48 h；3：发酵60 h；4：发酵72 h；5：发酵90 h1：fermentation time is 24 h;2：fermentation time is 48 h;3：fermentation time is 60 h;4：fermentation time is 72 h;5：fermentation time is 90 h

3 讨 论

本研究从腐烂的柚子皮上分离出一株黑色霉菌，通过对该菌株的形态特征和培养特征的观察，对照《真菌鉴定手册》判定该菌株为黑曲霉(Aspergillusnige)。该黑曲霉可产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶和果胶酶。由于柚子皮富含纤维素且该菌株对柚子皮的分解率达到73.33%左右，故以干柚子皮为主要原料，选取一株产纤维素酶活力较强的黑曲霉为生产菌株，采用固态发酵法生产纤维素酶。结果表明，固态发酵培养基中添加12 g柚子皮，0.5 g麸皮和0.5 g (NH4)2SO4，培养基初始含水量保持在68.5 mL/100 g，培养时间控制在60 h左右时生产纤维素酶较多。

本研究利用黑曲霉固态发酵柚子皮是一种较为经济环保的纤维素酶的制备方法，不仅可为柚子皮资源的再利用开辟了新的途径，也为黑曲霉固态发酵产纤维素酶提供了物美价廉的原料。

[1] 张熙,韩双艳. 黑曲霉发酵产酶研究进展[J]. 化学与生物工程,2016,33(1):13-16.

[2] Patel H, Chapla D, Divecha J, et al.Improved yield ofα-L-arabinofuranosidase by newly isolatedAspergillusnigerADH-11and synergistic effect of crude enzyme on Saccharification of maize stover[J]. Bioresources&Bioprocessing， 2015,11(2):157-169.

[3] 郭鲁宏,杨顺楷. 黑曲霉产生的酶类及其应用[J]. 天然产物研究与开发,1998,10(4):87-93.

[4] 吴发远. 黑曲霉发酵生产纤维素酶条件的研究[J]. 中国农学通报,2009,25(9):74-77.

[5] Yinbo Qu, Zhu Mingtian, Liu Kai. et al.Studies on cellulosic ethanol production for sustainable supply of liquid fuel in China[J].Biotechnology Journal,2006,1(11):1235-1240.

[6] 顾方媛，陈朝银,石家骥,等. 纤维素酶的研究进展与发展趋势[J]. 微生物学杂志,2008,28(1):83-87.

[7] 周殷,胡长伟,李鹤,等. 柚子皮吸附剂的物化特性研究[J]. 环境科学与技术,2010,33(11):87-91.

[8] 周殷,胡长伟,李建龙. 柚子皮吸附水溶液中亚甲基蓝的机理研究[J]. 环境科学研究,2008,21(5):49-54.

[9] 戚淑威. 产偏酸性蛋白酶菌株的筛选及其酶应用特性的研究[D].昆明：云南师范大学,2006.

[10]张宇昊,王颉,张伟,等. 一种改进的纤维素分解菌鉴别培养基[J]. 纤维素科学与技术,2004,1:33-36.

[11]徐冲,关艳丽,冯敏. 产果胶酶菌株的筛选[J]. 微生物学杂志,2013,33(5):66-68.

[12] GB 5009.3-2010 食品安全国家标准 食品中水分的测定[S].2010.

[13]苏香萍,龚大春,陈国华,等. 混合菌固态发酵产纤维素酶条件的研究[J]. 酿酒科技,2010，(9):21-24.

[14]陈华根. 产柚苷酶的黑曲霉菌株的筛选、产酶特性及高产菌株选育的研究[D].厦门：集美大学,2009.

[15]张帅,陈懿,董基,等. 黑曲霉固态发酵橘皮生产纤维素酶及淀粉酶[J]. 食品科学,2012,33 (11):190-193.

[16]Varzakas T H, Roussos S, Arvanitoyannis I S.Glucoamylases production ofAspergillusnigerin solid state fermentation using a continuous counter-current reactor[J]. International Journal of Food Science and Technology, 2008,43(7):1159-1168.

Identification and Characterization ofAspergillusnigerIsolated from Pomelo Peel

ZHANG Chao-feng, WANG Yu-chen, CHEN Wei-ping, ZHANG Feng-ying

(Coll.ofFoodSci. &Engin.,JiangxiAgric.Uni.,Nanchang334450)

Aspergillusnigernaturally grow on pomelo peel was separated and characterized, and investigated for its enzyme-producing features. Plate dilution method was used to isolate a mold strain, and it was identified through observing its morphological and culture features, and compare toFungiCharacterizationHandbookto judge the genus and species of the strain. The identification medium is adopted to discuss the enzyme production characteristics. Dried pomelo peels as major raw material, according to the component feature of pomelo peel, and the strain as producing strain, adopting solid state fermentation method to investigate the effects on cellulase activity of four factors, component of culture medium, the content of pomelo peel, the initial water content of the medium, as well as fermentation time. The result showed that the strain wasAspergillusnigerand it can produce four enzymes: amylase, protease, cellulase and pectinase; 12 g pomelo peels, 0.5 g wheat bran, and 0.5 g (NH4)2SO4, and initial water content at about 68.5 mL/100 g and fermentation time at about 60 h, the yield of cellulase was at the higher level..

pomelo peels;Aspergillusniger; solid state fermentation; cellulase

国家自然科学基金项目(31560480)；江西省科技计划项目(2009BNA09400)

张超凤 女，硕士研究生。从事微生物发酵研究。E-mail:1358440843@qq.com

* 通讯作者。女，研究员，硕士生导师。研究方向为农产品加工与贮藏。E-mail:3q3w3q3w@163.com

2016-07-04；

2016-10-10

Q93-331

A

1005-7021(2017)03-0022-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.03.004