脂环酸芽胞杆菌对果汁危害的研究

丁金英， 葛含静， 吴永娟 ， 杨苗苗*， 王 力， 南小宁

(1.宁夏职业技术学院，宁夏 银川 750021；2.西安丹若尔石榴酒业有限公司，陕西 临潼 710611；3.西北农林科技大学，陕西 杨凌 712100；4.陕西学前师范学院，陕西 西安 710100)

脂环酸芽胞杆菌对果汁危害的研究

丁金英1， 葛含静4， 吴永娟4， 杨苗苗4*， 王 力2*， 南小宁3

(1.宁夏职业技术学院，宁夏 银川 750021；2.西安丹若尔石榴酒业有限公司，陕西 临潼 710611；3.西北农林科技大学，陕西 杨凌 712100；4.陕西学前师范学院，陕西 西安 710100)

概述了脂环酸芽胞杆菌的种类、特点、性质、全基因组测序状况、果汁中脂环酸芽胞杆菌的来源、传播途径、对果汁的危害、鉴定检测方法等，并就该菌的研究意义、目前果汁生产中存在的问题等进行了分析，旨在为控制脂环酸芽胞杆菌的污染提供理论依据。

脂环酸芽胞杆菌；嗜酸耐热菌；果汁；酸败

脂环酸芽胞杆菌(Alicylobacillusspp.)，又称嗜酸耐热菌或耐热菌，中度嗜酸(pH 2.0～6.0)、耐热(45～45 ℃)、革兰阳性或少数生长后期可变为革兰阴性、严格需氧、杆状、产芽胞。脂环酸芽胞杆菌均具二级结构且其相似性极高，研究发现，Alicylobacilluspomorum细胞膜中不含有ω-环状脂肪酸，因此该属菌的显著特征已不再是胞膜中是否具有 ω-环状结构[1]。目前果汁生产中所采用的巴氏灭菌法无法消除脂环酸芽胞杆菌，该菌可引起酸性果汁腐败、后浑浊、产生白色沉淀并伴有不愉快气味等危害，严重影响到我国果汁，尤其是浓缩苹果汁的国际化发展[1-3]。本文概述了脂环酸芽胞杆菌种类、特性、快速检测、质量控制及目前果汁生产过程中存在的问题，并提出了控制该菌的建议，以期为减少果汁的危害提供理论依据。

1 脂环酸芽胞杆菌种类、全基因组序列情况、特点及性质

1.1 脂环酸芽胞杆菌的种类

Cerny于1982年首次从酸败的苹果汁中分离到嗜酸耐热菌并命名为脂环酸芽胞杆菌，Wisotzkey于1992年根据该菌细胞膜中不饱和脂肪酸的种类，将其划分为一个独立的属，目前，该菌现已增至 20个种、2个亚种和2个暂定种，主要包括A.acidocaldarius、A.acidiphilus、A.contaminans、A.cycloheptanicus、A.disulfidooxidans、A.fastidiosus、A.genomicspecis1、A.genomicspecis2、A.sendaiensis、A.herbarius、A.hespridum、A.mali、A.tolerans、A.pomorum、A.vulcanalis等[4-7]，Goto等构建了菌株之间的进化关系(图1)。

图1 脂环酸芽胞杆菌属部分菌株基因序列系统进化树[4]Fig.1 Phylogenetic distance tree derived from coMParison of the 16S rRNA gene sequences of Alicyclobacillus species[4]

1.2 脂环酸芽胞杆菌全基因组序列研究

目前有16株脂环酸芽胞杆菌完成了全基因组序列的测序，测序菌种名录见表1。详细信息见网址https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=29330。

1.3 脂环酸芽胞杆菌的特性及对果汁的危害

大多数脂环酸芽胞杆菌呈革兰阳性，Alicyclobacillusendaiensis为革兰阴性，A.fastidiosus生长后期呈革兰阴性，pH 2.5～6.0的酸性环境下生长，能在接近端点或终端产生芽胞，其中接近端点部位的芽胞结构有或没有肿胀芽胞囊。菌落(在BAM 培养上)呈白色，乳脂状，扁平，圆形，直径0.8～5.0 mm，中心稍凸起，有同心圆，不易挑起，半透明，不产生色素，无味[5-7]。大多数脂环酸芽胞杆菌细胞膜含有ω-环状结构的脂肪酸，Kannan等证明该结构的脂肪酸在细胞膜上紧密排列成环状，形成保护膜，耐受高温，这种性质为微生物在高温和低pH 的环境中生长提供了保障[1，8]。研究发现不同的脂环酸芽胞杆菌芽胞耐热性与关联的环境不同，A.cidoterrestris与热稳定蛋白、二吡啶酸的含量及矿质离子等有关，与pH无关；低酸条件下,A.cidoterrestris与Mn2+和Ca2+的结合能力比其他脂环酸芽胞杆菌强，此外，去矿物质化利于芽胞耐热[9]。

表1 16株全基因组测序的脂环酸芽胞杆菌

脂环酸芽胞杆菌Alicyclobacillus不危害浓缩酸性果汁，但当浓缩酸性果汁稀释成饮用果汁时，该菌就会繁殖代谢，常温下代谢产生具有难闻气味的2，6-二溴苯酚、2，6-二氯苯酚和愈创木酚(图2)，并产生沉淀，导致果汁后混浊，品质降低。

图2 脂环酸芽胞杆菌的主要代谢产物Fig.2 The main metabolites of Alicylobacillus spp.A:愈创木酚;B:2，6-二溴苯酚;C:2，6-二氯苯酚A:guaiacol;B:2,6-dibromophenol;C:2,6-dichlorophenol

2 果汁中的脂环酸芽胞杆菌来源、鉴定及其他分子生物学研究

2.1 脂环酸芽胞杆菌的来源

大量研究表明，土壤、温泉、肥料、硫磺矿、有机物、火山喷气孔湿土等环境均有脂环酸芽胞杆菌的分布，而其最根本的来源是土壤[4-7，10]。近年来，土壤、火山、温泉、有机物、矿物质、果园、果汁加工车间中空气、车间加工水、巴氏灭菌酸性果汁、热加工食品、苹果、梨、柠檬、橘子、蔓越橘、香蕉、樱桃、黑醋栗、蓝莓、葡萄柚、芒果、菠萝、番茄、西瓜等及其水果加工制品中分离到了脂环酸芽胞杆菌[11-19]。作者从陕西渭南苹果园土壤及落果中分离到了脂环酸芽胞杆菌[20]。

研究认为脂环酸芽胞杆菌是导致果汁酸败的主要原因，而果汁中该菌的最初来源为土壤，然后通过落果、烂果、果皮、已感染的加工车间设备及空气等途径进入果汁[1,7，21]。

2.2 脂环酸芽胞杆菌的鉴定研究方法

2.2.1 形态学鉴定法 脂环酸芽胞杆菌呈杆状，菌落乳白色不透明，菌落直径0.8～5 mm，表面较光滑或有同心圆，扁平或中心凸起，随着菌龄的增长，菌落颜色逐渐加深直至褐色，无味，营养体细胞(3.0～5.0)μm×(0.7～1.0)μm，芽胞中生、端生或次端生，营养细胞随着芽胞的萌发逐渐膨大[22]。

2.2.2 基于16S rDNA的同源性分析法 近年来，16S rDNA序列分析技术已广泛应用于微生物同源性分析。我国已成功建立了基于16SrDNA-PCR-RFLP技术实现快速分类和鉴定苹果浓缩汁全产业链中嗜酸耐热菌的方法[23]。Goto等[5]和 Mignard等[24]通过分析16S rDNA可变区实现了不同脂环酸芽胞杆菌之间的区分，研究发现利用该菌属高度可变区5′端进行不同菌种鉴定时，其序列相似性为82.3%～98.1%。

2.2.3 代谢产物分析法 引起酸性果汁酸败的主要物质是脂环酸芽胞杆菌的3种代谢产物，愈创木酚、2，6-二氯苯酚和 2，6-二溴苯酚(图2)[5，25]。其中，代表性的代谢产物是愈创木酚，该物质在果汁中的含量很高，具有很强的挥发性。因此，可以利用果汁中愈创木酚的检测结果判断果汁是否被脂环酸芽胞杆菌所污染[26-28]。目前愈创木酚的主要检测方法是定量检测试剂盒[29]和气相质谱-质谱联用方法(GC-MS)[30]。Zierler等、杨康[31]和袁亚宏[10]分别在GC-MS基础上建立了基于顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用分析(SPME-GC-MS法)的愈创木酚快速检测方法。此外Orr等[32]构建了气相色谱嗅觉器-气相色谱-质谱仪串联法和感官评价与气相色谱结合法。

2.2.4 API-50 CHB系统鉴定方法 API鉴定系统被誉为细菌鉴定的“国际金标准”。刘晓柯[33]将 API-50 CHB试剂条与微量pH计结合起来，构建的脂环酸芽胞杆菌的快速鉴定方法，实现了微生物快速鉴定与分型。

2.2.5 其他快速分离与检测技术 近年来，实时荧光定量 PCR(Real-time PCR)、聚合酶链式反应(PCR)、傅里叶变换近红外光谱(FT-IR)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、电子鼻、免疫磁性微球及与其他检测方法联用等方法也应用于脂环酸芽胞杆菌的检测，在此基础上构建的脂环酸芽胞杆菌检测方法及分离技术体系大大提高了该菌分离和检测的效率，脂环酸芽胞杆菌快速检测试剂盒更是具有快速、便捷、准确、灵敏等快速检测的优势特点[34-35]。

2.3 分子生物学研究

在全基因组测序的基础上，脂环酸芽胞杆菌的遗传特征、环境的适应性机理及代谢途径、耐热、耐酸、耐氧化等基因克隆及其生物学信息的研究也成为近年来的研究热点[36]。如，在分子水平上解析脂环酸芽胞杆菌耐热、酸、氧化等环境胁迫适应性机制的基础上，通过转基因技术开发耐高温、耐酸或耐其他环境胁迫的高效发酵微生物，为发酵业开发新的发酵菌株提供了理论基础[37]。

3 脂环酸芽胞杆菌对果汁的危害

迄今为止没有脂环酸芽胞杆菌对人类健康产生影响的报道[5]。但脂环酸芽胞杆菌对酸性果汁尤其是苹果浓缩汁及其加工产业却造成了严重的威胁。当苹果汁饮料中可溶性固形物含量小于 18 °Brix 时，脂环酸芽胞杆菌可大量繁殖并代谢产生伴有消毒水气味的愈创木酚、2-6-二溴苯酚和 2-6-二氯苯酚等物质导致果汁酸败，饮料容器底部产生不溶性白色沉淀，果汁酸败浊度升高、颜色变深，严重影响果汁的感官品质和营养成分。

4 脂环酸芽胞杆菌研究意义、存在问题及展望

自二十世纪末在欧美、日本先后发生苹果汁酸败事件以来，脂环酸芽胞杆菌引起了世界高度关注。目前，中国已成为世界最大的苹果浓缩汁生产国和出口国，果汁生产中采用的巴氏杀菌方法无法消除脂环酸芽胞杆菌，该菌已成为严重影响中国浓缩苹果汁国际化发展的“绿色技术壁垒”之一[2，32]。因此，建立精确、高效、便捷的脂环酸芽胞杆菌鉴定检测方法、安全质量控制体系及受污染产品的处理方法对保证和促进中国苹果汁产业的健康发展具有十分重要的社会意义。

大量研究表明，脂环酸芽胞杆菌是导致果汁酸败的主要原因之一，其最初来源于果园土壤，然后通过落果、烂果、果皮、已感染的加工车间设备、车间空气等途径传播[1，6-7，22]。近年来，中国浓缩汁苹果产量及出口量在国际贸易中占据重要比例，但俄罗斯、美国、加拿大、日本等浓缩汁苹果的主要进口国对苹果汁产品的品质和安全性提出了高标准要求，同时，苹果汁需求国政府为了保护本国苹果产业，进一步提高了进口苹果产品的检测标准。而目前中国众多的果汁企业为了降低成本，以落果、烂果为果汁的主要加工原料，由此生产的苹果汁存在脂环酸芽胞杆菌污染是不可避免的，在进口国高标准的要求下，中国的苹果浓缩汁产业必定面临着严峻的挑战。目前该菌的防治主要集中在原料选择、剔除烂果，清洗和消毒加工车间设备，成品中采用抑菌物等措施，一定程度上减少了果汁中脂环酸芽胞杆菌的污染。但由于该菌生长的特殊环境加之其在低浓度和常温下繁殖速率非常快，从根本上满足不了国际标准的要求。因此，要减少脂肪酸芽胞杆菌对果汁的危害，须从生产的各个环节进行控制，而最切实有效的方法是从源头上控制，避免利用落果、烂果生产果汁，避免储存和运输过程造成腐烂。

脂环酸芽胞杆菌作为影响苹果浓缩汁产业的关键安全因子之一，严重制约了中国苹果及其加工产业的国际化发展。因此，控制果汁中脂环酸芽胞杆菌的污染，提高苹果汁品质具有非常重要的社会意义。针对目前苹果汁脂环酸芽胞杆菌的研究现状和存在的问题，有以下几点建议：① 健全果汁质量监管体系，借鉴目前美国、日本等发达国家广泛应用于食品企业的国际通用质量保证体系——“危害分析及关键控制点(HACCP)”来规范我国果汁质量安全监管，并将该体系完善规范化延伸于整个食品安全管理。② 在浓缩苹果汁的生产上要从原料抓起，避免采用落果、烂果进行果汁加工，对各个生产加工环节严格把关。③ 将已建立的快速检测手段运用于果汁生产的各个环节，如抽检加工原料，建立该菌污染的应急措施，避免造成后期损失等。④ 目前脂肪酸芽胞杆菌的分离、鉴定和果汁生产过程中的防控研究较多，而对土壤中该菌的萌发、繁殖和有效控制方法研究较少，以期从源头上控制该菌的研究尚处于空白，相比之下在植物病害防控方面，致病菌孢子的萌发条件、生物防治等已有大量研究。因此，如何控制土壤中脂肪酸芽胞杆菌，从源头上控制该菌有待进一步研究。

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Harm ofAlicylobacillusspp. to Fruit Juice

DING Jin-ying1, GE Han-jing4, WU Yong-juan4, YANG Miao-miao4, WANG Li2, NAN Xiao-ning3

(1.NingxiaColl.ofVocat′lTechnol.,Yinchuan750021; 2.ThecompanyoftheXiaoTanerelPomegranateBrewerg,Lintong710611;3.NWUni.ofAgric, &Forestry,Yangling712100；4.ShaanxiPreschl.NormalColl.,Xi′an710100)

The kinds, features, characteristics, and the status of complete genome sequencing, the source ofAlicylobacillusspp. in fruit juice, its transmission pathway, its harm to fruit juice, and identification and detection method ofAlicylobacillusspp. were outlined. At the same time, the research significance and the existing problems in present juice production were analyzed, aiming to provide the theoretical references to control contamination ofAlicylobacillusspp.

Alicylobacillusacidoterrestris; thermophilous acidophilic bacteria; juice; rancidity

陕西省教育厅科研计划项目(15JK1183)；陕西省科技计划项目(2016NY-204,2016JQ3036)

丁金英 女，博士，三级教授。主要从事生物学科研及教学工作。E-mail: djy1958@126.com

* 通讯作者。杨苗苗，女，博士，助理研究员。主要从事植物保护及其生物制品研究。E-mail: yangmmgg@163.com

2016-12-23；

2017-03-17

Q939.97

A

1005-7021(2017)03-0128-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.03.021

王力 男，大专，初级工程师。主要从事果汁加工生产与研究工作。E-mail:489674175@qq.com

杨苗苗为共同通讯作者，贡献等同于王力。