IL-2及IL-2Rα基因多态性与汉族儿童支气管哮喘的关联

刘冬松，刘安兵，陈岳明

（1.浙江省金华市中医医院 检验科，浙江 金华 321017；2.浙江省杭州市第一人民医院检验科，浙江 杭州 310006）

IL-2及IL-2Rα基因多态性与汉族儿童支气管哮喘的关联

刘冬松1，刘安兵2，陈岳明2

（1.浙江省金华市中医医院 检验科，浙江 金华 321017；2.浙江省杭州市第一人民医院检验科，浙江 杭州 310006）

目的探讨IL-2（rs6822844）及IL-2Rα（rs2104286）基因多态性和汉族儿童支气管哮喘发生的关联。方法随机选取144例支气管哮喘患儿为病例组，228例健康儿童为对照组。用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）直接测序鉴定各位点基因型；同时采用qRT-PCR检测对照组IL-2Rα各基因型外周血IL-2Rα信使核糖核酸（mRNA）相对表达量，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测各基因型血浆sIL-2Rα水平。结果IL-2Rα（rs2104286）位点等位基因A在病例组分布频率（86.8%）高于对照组（79.4%）（=1.708，95%CI：1.113，2.629，P=0.010），病例组中AA基因型分布频率（75.0%）高于对照组（62.3%）（=1.745，95%CI：1.058，2.884，P=0.021）；未发现IL-2（rs6822844）位点有多态性分布。对照组中IL-2Rα（rs2104286）位点AA基因型个体外周血IL-2Rα mRNA相对表达量以及血浆sIL-2Rα水平均高于AG基因型（Z=-2.029和-2.361，P =0.043和0.018）。结论IL-2Rα（rs2104286）基因多态性可能与汉族儿童支气管哮喘发生相关，而且该位点基因型可影响其转录及表达。

支气管哮喘；基因多态性；白细胞介素2；白细胞介素2a受体

支气管哮喘是儿童常见的变态反应性疾病之一，是由肥大细胞、嗜酸性粒细胞及T淋巴细胞参与的慢性气道炎症并导致气道高反应，出现反复发作的喘息、呼吸困难、胸闷及咳嗽等症状。全球范围内哮喘发病越来越普遍，目前约有3.34亿人患病[1]。2010年中国国家儿童哮喘协作组调查显示儿童哮喘全国流行率约0.42%～5.73%，全国平均水平约2.32%[2-3]。辅助性T细胞1型（T helper 1 cell，Thl）和辅助性T细胞2型（T helper 2 cel，Th2）比值失衡是哮喘发病的一个重要机制[4]。白细胞介素2（interleukin-2，IL-2）是Thl型细胞分泌的重要细胞因子。白细胞介素2α受体（interleukin-2 receptor alpha，IL-2Rα）与IL-2结合在调节免疫系统功能方面起关键作用。IL-2Rα脱落入血液后形成可溶性IL-2Rα（soluble interleukin-2 receptor alpha，sIL-2Rα）。研究显示，支气管哮喘患者肺泡灌洗液IL-2水平升高，中度持续性哮喘患者血清sIL-2Rα也高于轻度持续性哮喘患者[5-6]。细胞因子的合成受遗传因素影响[7]，因此，哮喘除环境因素外，患者的遗传背景同样起重要作用。本研究以汉族支气管哮喘儿童为病例组，以汉族健康儿童为对照组，分析两组IL-2（rs6822844）及IL-2Rα（rs2104286）多态性位点等位基因频率、基因型分布差异，旨在鉴定上述位点与汉族儿童支气管哮喘发生的关联。

1 材料与方法

1.1 材料

选取2013年8月～2015年12月在金华市中医医院和杭州市第一人民医院儿科门诊及住院的汉族支气管哮喘患儿。依据2008年中华医学会儿科学分会呼吸学组修订的儿童哮喘防治常规[8]确诊为支气管哮喘的急性发作期儿童144例为病例组。其中，男性79例，女性65例；年龄6个月～11岁，中位年龄3.7岁；病程2个月～7年，中位数2.4年。以杭州市第一人民医院儿童保健门诊228例汉族健康儿童为对照组。其中，男性123例，女性105例；年龄6个月～10岁，中位年龄3.2岁；无呼吸道及其他部位感染以及过敏反应史；各组均除外有呼吸衰竭、心力衰竭及先天性心脏病等疾病者；病例组和对照组间性别、年龄差异无统计学意义。所有研究对象均对本研究知情同意并签署知情同意书，本研究获得金华市中医医院及杭州市第一人民医院医学伦理委员会审核批准。

1.2 标本收集及基因组脱氧核糖核酸DNA提取

全部对象采集空腹乙二胺四乙酸二钾抗凝静脉血2ml各2管。其中，1管用于基因组DNA提取，采用全血基因组DNA提取试剂盒（购自北京天根生化科技有限公司），按照说明书进行操作，提取的DNA样本采用紫外分光光度计确定DNA的纯度和浓度，置入-20℃冷冻备用。另一管置2000r/min离心5min后，取血浆1ml置入-20℃冰箱冷冻备用。

1.3 基因型鉴定

实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative realtime polymerase chain reaction，qRT-PCR）扩增引物均经在线软件设计（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/ primer-blast/），由上海辉睿生物技术有限公司合成。PCR扩增体系包括：10×缓冲液（无Mg2+离子）5μl，脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphos phate，dNTP）（10mmol/L）4μl，Mg2+（25mmol/L）3μl，正向引物（10 nmol/L）1μl，反向引物（10 nmol/L）1μl，模板DNA 5μl，Taq DNA聚合酶（5 u/μl）1μl，用去离子水补齐至50μl反应体系（日本TaKaRa Bio株式会社）。引物序列及扩增条件见表1。PCR产物由上海生工生物工程股份有限公司完成，测序引物为正向引物。

1.4 IL-2Rα mRNA相对表达量

按基因型结果，随机抽取对照组中AA基因型、AG基因型标本各50例。用Trizol（美国英维捷基公司）提取全血总RNA，按照Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（立陶宛Fermentas公司）说明书操作合成互补DNA（complementary DNA，cDNA）。SYBR GreenⅠqRT-PCR检测IL-2Rα mRNA相对表达量，扩增引物分别为，正向引物：5'-GGTCCC AGGCAGAGAATCAT-3'；反向引物：5'-CACCTTGTGTGTCCACCTGTA-3'。以β-肌动蛋白（beta-actin，β-actin）作为内参照基因，正向引物：5'-CTACAATG AGCTGCGTGTGG-3'；反向引物：5'-AAGGAAGGCTG GAAGAGTGC-3'。由上海辉睿生物技术有限公司合成。qRT-PCR检测试剂购自日本TaKaRa Bio株式会社，反应体系按说明书进行配制。PCR反应循环参数为：95℃变性3min后进行40个循环，包括95℃变性10s，60℃退火和延伸34s。根据2-ΔΔCt法来计算IL-2Rα mRNA相对表达量[9]。

表1 候选基因PCR引物序列及扩增条件

1.5 血浆sIL-2Rα水平检测

上述对照组中AA基因型、AG基因型标本相对应的血浆sIL-2Rα检测采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）（美国Creative Diagnostics公司）。该试剂检测线性范围31.25～2 000.00 pg/ml，检测下限为16 pg/ml。实验操作严格按说明书进行。

1.6 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计软件，Hardy-Weinberg遗传平衡定律吻合度检验、病例与对照组基因型和等位基因频率分布均用χ2检验；关联分析用95%可信区间（confidence interval，CI）的比值比（odds ratio）表示。不同基因型个体组间IL-2Rα mRNA相对表达量及血浆sIL-2Rα水平用Mann-Whitney检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 候选基因位点等位基因频率及基因型分布

本研究未发现IL-2（rs6822844）位点有多态性分布，该位点等位基因均为G。IL-2Rα（rs2104286）位点等位基因及基因型分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律（χ2=0.517，P＞0.050）基因型测序结果。IL-2Rα（rs2104286）位点等位基因A在病例组分布频率（86.8%）高于对照组（79.4%）95%CI=1.113，2.629，P=0.010）；病例组中AA基因型分布频率（75.0%）高于对照组（62.3%）95%CI=1.058，2.884，P=0.021）。见图1和表2。

2.2 IL-2Rα mRNA相对表达量

AA基因型携带者相对表达量（1.263±0.625）高于AG基因型携带者（1.044±0.436）（Z=-2.029，P=0.043）。见图2。

2.3 IL-2Rα（rs2104286）位点不同基因型个体血浆sIL-2Rα水平

AA基因型个体血浆sIL-2Rα水平（157.86± 67.21）高于AG基因型（126.41±58.63）（Z=-2.361，P=0.018）。见图3。

图1 IL-2Rα（rs2104286）、IL-2（rs6822844）位点基因型测序图

表2 候选基因位点等位基因频率及基因型分布 例（%）

图2 IL-2Rα（rs2104286）位点不同基因型IL-2Rα mRNA相对表达量

图3 IL-2Rα（rs2104286）位点不同基因型个体血浆sIL-2Rα水平

3 讨论

IL-2是诱导Th1细胞分化增殖的主要细胞因子之一，在哮喘患者中IL-2激活Th2细胞触发和维持气道炎症，刺激免疫球蛋白E分泌和黏液过度产生。T细胞膜表面的IL-2Rα脱落于血液形成sIL-2Rα，其不但是IL-2介导免疫应答的调节拮抗蛋白，而且是一种类似封闭因子的免疫抑制物，能中和T细胞产生过多的IL-2，起到免疫调控作用[10]。

研究显示，IL-2（rs6822844）、IL-2Rα（rs2104286）均和Thl/Th2失衡相关疾病有关，如IL-2（rs6822844）位点与类风湿关节炎[11]、系统性硬化病[12]；IL-2Rα（rs2104286）位点和1型糖尿病[13]及幼年特发性关节炎等[14]。然而，上述位点与支气管哮喘发生的关联目前还少见报道，特别是在中国汉族儿童中。本研究结果显示，IL-2Rα（rs2104286）位点等位基因A相对于G是致病基因；AA基因型个体患病风险高于AG基因型个体。在本研究的样本量内未发现IL-2（rs6822844）位点在中国汉族儿童中有多态性分布。

IL-2Rα（rs2104286）位于该基因第一个内含子内。CHISTIAKOV等[15]报道，对照组内AA基因型个体血清sIL-2Rα水平均高于其他基因型，而在毒性弥漫性甲状腺肿病例组内各基因型间未发现差异。本研究同样发现，对照组中AA基因型个体外周血IL-2Rα mRNA相对表达量以及血浆sIL-2Rα水平均高于AG基因型，提示rs2104286可能是IL-2Rα基因的一个功能性位点。许多自身免疫性疾病中IL-2Rα（CD25）单抗在降低疾病活动性方面已显示出很好的疗效，其效应不仅直接作用于T细胞，而且作用于自然杀伤细胞和树突状细胞[16]。最近，针对细胞因子在哮喘患者炎症级联反应中的复杂作用，学者们同样认为IL-2Rα拮抗剂可能是一个治疗哮喘有希望的药物[17]。

综上所述，IL-2Rα（rs2104286）可能与汉族儿童支气管哮喘发生相关，而且该位点可影响基因转录及表达。此外，研究结果还提示，IL-2Rα可能是治疗哮喘的一个潜在、有效的靶点，其基因型同时在指导个体化用药方面有临床意义。

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Association ofIL-2andIL-2Rαpolymorphisms with bronchial asthma in Chinese Han children

Dong-song Liu1,An-bing Liu2,Yue-ming Chen2
(1.Department of Laboratory Medicine,Jinhua Hospital of Traditional Chinese Medicine, Jinhua,Zhejiang 321017,China;2.Department of Laboratory Medicine,Hangzhou First People's Hospital,Hangzhou,Zhejiang 310006,China)

ObjectiveTo investigate the relationship betweenIL-2 (rs6822844)andIL-2Rα(rs2104286) gene Polymorphisms and bronchial asthma in Chinese Han children.MethodsA gender and age-matched case control study was conducted.A total of 144 children with bronchial asthma were enrolled into the case group and 228 healthy children into the control group randomly.The genotypes were determined by direct sequencing forthe productsoffluorescentquantitative polymerase chain reaction (PCR).The relative expression ofIL-2Rα mRNA in the peripheral blood was analyzed by real-time fluorescent PCR.The expression levels of plasma sIL-2Rα were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)for the different genotype carriers in the control group.ResultsThe allele A distribution frequency ofIL-2Rα (rs2104286)in the case group(86.8%)was significantly higher than that of the control group(79.4%)[O＾R=1.708 (95%CI:1.113,2.629),P=0.010].The AA genotype frequency distribution in the case group (75.0%) was higher than that of the control group (62.3%)[O＾R=1.745 (95%CI:1.058,2.884),P=0.021].Thepolymorphism distribution ofIL-2 (rs6822844)was not found in the study.Additionally,both relative expression ofIL-2Rα mRNA in the peripheral blood and the plasma sIL-2Rα level of the individuals with AA genotype were significantly higher than those with AG genotype in the control group(P=0.043 and 0.018, respectively).ConclusionsThe gene polymorphism ofIL-2Rα (rs2104286)may be associated with the occurrence of bronchial asthma in Chinese Han children,and may regulate gene transcription and expression.

bronchial asthma;gene polymorphism;interleukin-2;interleukin-2 receptor alpha

R562.25

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.18.007

1005-8982（2017）18-0038-05

2016-12-15

陈岳明，E-mail：hzsylab@163.com