结肠癌患者ΔNp63和NF-κB的表达及意义

樊晓静，史志涛，孙昕

（新疆医科大学附属自治区中医院 普外一科三组，新疆 乌鲁木齐 830000）

结肠癌患者ΔNp63和NF-κB的表达及意义

樊晓静，史志涛，孙昕

（新疆医科大学附属自治区中医院 普外一科三组，新疆 乌鲁木齐 830000）

目的探讨结肠癌患者N末端截短型p63基因（ΔNp63）和核转录因子κB（NF-κB）的表达及意义。方法采用免疫组织化学法检测结肠癌患者ΔNp63和NF-κB的表达；采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和Western blot检测ΔNp63和NF-κB信使核糖核酸（mRNA）和蛋白的表达；采用半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase-3）活性检测试剂盒检测凋亡蛋白Caspase-3表达。结果与对照组比较，结肠癌患者ΔNp63蛋白表达升高35.57%，NF-κB蛋白表达升高58.93%，差异有统计学意义（P＜0.05）；结肠癌患者ΔNp63和NF-κB mRNA和蛋白表达均升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；结肠癌患者Caspase-3活性升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论结肠癌患者ΔNp63和NF-κB呈过度表达状态；ΔNp63和NF-κB的过表达在结肠癌发生、发展机制中可能起到重要作用。

结肠癌；N末端截短型p63基因；核转录因子κB；免疫组织化学

结肠癌是世界范围内发病最为广泛的恶性肿瘤之一，其发病率与病死率呈逐年上升趋势[1-2]。结肠癌的发病由环境、饮食、生活习惯及遗传等多因素共同作用[3]，但结肠癌的发病机制迄今尚不明确。研究表明，原癌基因的激活和肿瘤抑制基因的失活在结肠癌的发生、发展过程中起到重要作用[1-3]。N末端截短型p63基因（N distal end brachytmema p63 gene，ΔNp63）是抑癌基因p53家族成员之一，参与细胞周期抑制和细胞凋亡的调控[4-5]；核转录因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）是一类具有多向调节作用的核转录因子，参与调节多种凋亡相关基因的表达[6-7]。ΔNp63和NF-κB的调解作用可能参与结肠癌的发生、发展过程，本研究主要探讨ΔNp63和NF-κB在结肠癌组织中的分布，以及ΔNp63和NF-κB蛋白表达变化和作用意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本材料 选取2014年9月-2016年7月本院肿瘤外科收集的85原发性结肠癌标本，均经组织病理学确诊。其中，男性49例，女性36例；平均发病年龄52岁（24～76岁）；低分化腺癌23例，高中分化腺癌62例；侵及黏膜和浅肌层15例，至深肌层和全层70例；无淋巴结转移17例，有淋巴结转移68例。同时，取35例手术末端未见肿瘤浸润的正常结肠组织标本作为对照。研究符合伦理委员会相关规定，并经本院医学伦理委员会批准。

1.1.2 实验材料 一抗ΔNp63、NF-κB及肌动蛋白（β-actin，ACTB）单克隆抗体（购于美国Abcam公司），二抗碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG、DAB染色盒、抗体稀释液及中性树脂（购于北京中杉金桥有限公司），实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）试剂盒（购自日本TaKaRa公司），Caspase-3活性检测试剂盒（上海碧云天生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学法检测ΔNp63和NF-κB的蛋白表达水平 取患者的结肠癌病理石蜡标本及正常结肠组织标本共120例，分别进行连续切片6张（8 μm/张）。用5%血清进行室温封闭40min后，分别加入1∶1 000的ΔNp63或NF-κB单克隆抗体4℃过夜孵育。隔天加入1∶1 000的二抗37℃孵育30min，PBS清洗后加入SP后进行恒温反应30min，加入DAB显色液进行显色，中性树胶封片后用（×10、×40）显微镜进行观察。阳性染色：ΔNp63和NF-κB的阳性表达主要表现为细胞内出现棕黄色颗粒。（×40）显微镜下观察，随机选择5个高倍视野，采用IPP软件进行图像扫描分析，收集数据并计算图片中ΔNp63和NF-κB蛋白表达的平均光密度（mean optical density，MOD）。MOD=累积光密度（integrated optical density，IOD）与面积（area）的比值，用于反应组织中ΔNp63和NF-κB蛋白的表达含量。

1.2.2 qRT-PCR检测标本中ΔNp63和NF-κB mRNA表达含量 Trizol法提取结肠癌组织中的总RNA，用TaKaRa公司的Prime Script RT试剂盒逆转录合成cDNA后，用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒进行qRT-PCR操作。每个样本设4个重复孔，每个目的基因重复3次。最终得到Ct值（threshold cycles）和溶解曲线的参数，实验采用相对定量法，根据公式计算出待测样品中目的基因（β-actin）和管家基因的准确含量，以样本的目的基因与管家基因之间含量比值，即循环阈值（cycle threshold，Ct）值比较法作为评价目的基因表达量的指标进行分析，计算不同样本间的相对百分比。公式：ΔΔCt=（Ct实验组的基因-Ct实验组管家基因）-（Ct对照组目的基因-Ct对照组管家基因）。目的mRNA的量=2-ΔΔCt。

1.2.3 Western blot检测ΔNp63和NF-kB的蛋白表达水平 收集结肠癌组织，加入裂解液冰上裂解2h。用BCA试剂盒进行蛋白浓度检测，将各组蛋白浓度总量调整为30μg/μl。将各组蛋白样品加入到10%SDS聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，转膜至PVDF膜后按1∶1 000的稀释比例加入一抗和二抗。用ECL显色剂显色，并对各泳道条带进行灰度扫描，计算蛋白的表达量。

1.2.4 凋亡蛋白活性检测试剂盒检测Caspase-3取组织裂解离心并收集蛋白上清液，稀释后加入反应缓冲液（reaction buffer含10 mol/LDTT）及5μl 4 mol/L LEHD-pNA底物，37℃孵育1h。酶标仪405nm测定其吸光度A值。Caspase-3活性单位（u）=（各组A值-凋零组A值）/标准曲线斜率，每次重复3孔。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ΔNp63和NF-κB免疫组织化学结果

正常结肠组织和结肠癌组织中的ΔNp63蛋白免疫组织化学染色强度差异有统计学意义，结肠癌组织中ΔNp63呈高表达水平。正常结肠组织和结肠癌组织中的NF-κB蛋白免疫组织化学染色强度差异有统计学意义，结肠癌组织中NF-κB呈高表达水平。见图1、2。

图1 ΔNp63的蛋白表达

图2 NF-κB的蛋白表达

2.2 ΔNp63和NF-kB的蛋白表达水平

免疫组织化学结果分析显示，结肠癌组织中ΔNp63蛋白表达比正常结肠组织中的蛋白表达增加（P=0.000），ΔNp63的蛋白表达量增加35.57%；结肠癌组织中NF-κB蛋白表达比正常结肠组织中的蛋白表达增加（P=0.000），NF-κB的蛋白表达量增加58.93%。见附表。

2.3 ΔNp63和NF-κB mRNA表达情况

与正常结肠组织ΔNp63 mRNA表达（1.00± 0.00）比较，结肠癌组织中ΔNp63 mRNA表达升高（1.37±0.12），差异有统计学意义（t=43.740，P=0.000），NF-κB mRNA表达升高（1.84±0.15），差异有统计学意义（t=80.950，P=0.000），说明结肠癌组织中ΔNp63和NF-κB mRNA水平高度表达。

2.4 ΔNp63和NF-κB蛋白表达

Western blot结果分析显示，与正常结肠组织ΔNp63蛋白表达（0.55±0.03）比较，结肠癌组织中ΔNp63蛋白表达升高（0.74±0.06），差异有统计学意义（t=14.060，P=0.000）。与正常结肠组织NF-κB蛋白表达（1.27±0.12）比较，NF-κB蛋白表达升高（1.89± 0.13），差异有统计学意义（t=15.620，P=0.000），说明结肠癌组织中ΔNp63和NF-κB蛋白水平呈高度表达。见图3。

附表 ΔNp63和NF-κB的蛋白表达变化 （±s）

附表 ΔNp63和NF-κB的蛋白表达变化 （±s）

组别NF-κB蛋白表达正常结肠组织 0.684±0.039 0.857±0.024结肠癌组织 0.941±0.029 1.362±0.037 t值 23.650 51.210 P值 0.000 0.000ΔNp63蛋白表达

2.5 Caspase-3活性检测试剂盒检测结果

与正常结肠组织Caspase-3活性（0.64±0.04）u比较，结肠癌组织中的Caspase-3活性（0.75±0.08）u提高，差异有统计学意义（t=6.559，P=0.000）。

图3 ΔNp63和NF-κB蛋白表达

3 讨论

结肠癌是人类健康与生命威胁最大的恶性肿瘤之一[1]，研究表明，原癌基因的激活和肿瘤抑制基因的失活在结肠癌的发生、发展过程中起到重要作用[3]。ΔNp63（特异性标记凋亡的缺乏酸性N端反式激活区的截短型p6）是抑癌基因p53家族成员之一，是p63在肿瘤发生、发展过程中的主要表达形式[4-8]。ΔNp63通过阻断TAp63和p53介导的反式激活，竞争性与DNA结合，在抑制细胞周期和调控细胞凋亡发生过程中起到重要作用[9-10]。NF-κB作为一种多向转录调节作用的核蛋白因子，在炎症、氧化应激及细胞增殖等生理病理过程中发挥作用[11-12]，激活后可密切参与凋亡基因的转录调控及细胞凋亡的过程[13-14]，最终导致效应性Caspase-3活化，胞核内DNA链断裂，细胞结构的全面解体，细胞死亡发生[15]。

本研究结果显示，与正常结肠标本组织比较，结肠癌组织中ΔNp63和NF-κB的蛋白表达含量均上升；同时Western blot结果也显示结肠癌组织中ΔNp63和NF-kB的蛋白表达含量上调。结肠癌组织中ΔNp63和NF-κB mRNA表达含量均与比正常结肠组织mRNA表达升高。结果表明在基因与蛋白水平上ΔNp63和NF-kB均呈过度表达状态，参与结肠癌的发展。且由于ΔNp63和NF-κB表达含量的异常性升高，不仅调控结肠癌的细胞的增殖过程，更加速细胞凋亡的过程，促使凋亡基因Caspase-3活性升高。结果说明ΔNp63和NF-κB的特异性表达加速细胞凋亡的过程，促进结肠癌细胞的凋亡发生。

综上所述，ΔNp63和NF-κB在结肠癌的发生和发展过程中发挥一定的抑癌作用，加速细胞凋亡的发生，但ΔNp63和NF-κB如何调控相关抑癌基因及加速细胞凋亡的作用机制还需进一步研究。在正常人群中，结肠上皮细胞中的ΔNp63的异常表达可能提示结肠癌的发生，联合检测NF-kB的蛋白表达含量有助于结肠癌的诊断与确诊，为临床治疗提供有效的帮助。

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Expression of ΔNp63 and NF-κB in colon cancer patients and significance

Xiao-jing Fan,Zhi-tao Shi,Xin Sun
(Department of General Surgery,Xinjiang Uyghur Autonomous Region Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Xinjiang Medical University,Urumqi,Xinjiang 830000,China)

ObjectiveTo investigate the expression and effect of ΔNp63 and NF-κB in patients with colon cancer.MethodsThe expressions of ΔNp63 and NF-κB in patients with colon cancer were detected by immunohistochemical method.The mRNA and protein expressed by ΔNp63 and NF-κB were detected by real-time polymerase chain reaction (RT-PCR)and Western blot.The expression of Caspase-3 in apoptotic cells was detected by Caspase-3 activity assay kit.ResultsCompared with the control group,the level of protein expressed by ΔNp63 rose by 35.57%and the level of protein expressed by NF-κB rose by 58.93%, the difference was statistically significant(P＜0.05).The mRNA and protein expressed by ΔNp63 and NF-κB were obviously up-regulated,the differences were statistically significant (P＜0.05).The activity of Caspase-3 in the colon cancer group was obviously increased,the difference was statistically significant(P＜0.05).ConclusionsThe expressions of ΔNp63 and NF-κB in colon cancer patients are over-expressed,and the over-expressed ΔNp63 and NF-κB may play important roles in the development and progression of colon cancer.

colon cancer;Np63;NF-κB;immunohistochemistry

R735.35

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.18.005

1005-8982（2017）18-0028-04

2017-01-05