＜3岁反复喘息患儿外周血血清ORMDL3基因在不同临床表型中的表达及其与IL-17和ECP的关系

郑虹，王威，何昭，刘金宝，钟剑

（广东省惠州市第一人民医院 儿科，广东 惠州 516000）

＜3岁反复喘息患儿外周血血清ORMDL3基因在不同临床表型中的表达及其与IL-17和ECP的关系

郑虹，王威，何昭，刘金宝，钟剑

（广东省惠州市第一人民医院 儿科，广东 惠州 516000）

目的探讨＜3岁反复喘息患儿外周血血清类黏蛋白1样蛋白3（ORMDL3）基因在不同临床表型中的表达及其与血清白介素-17（IL-17）和嗜酸性细胞阳离子蛋白（ECP）的关系。方法选取该院儿科就诊＜3岁反复哮喘的患儿87例，根据患儿是否存在高危因素分成特应性哮喘组（64例）和非特应性哮喘组（23例），再选取同期在儿科体检的健康儿童30例。分析3组研究对象ORMDL3基因表达水平、血清IL-17和ECP含量和ORMDL3基因频率分布的差异，并对3组研究对象ORMDL3基因表达水平和血清IL-17和ECP含量的相关性进行分析。结果特应性哮喘组ORMDL3基因表达水平（11.57±1.96）%，血清IL-17（1 354.46± 873.48）pg/ml和血清ECP（45.65±12.76）μg/L均高于非特应性哮喘组和对照组（P=0.000）；3组的ORMDL3基因AA、AG和GG 3种基因型的频率分布差异有统计学意义（χ2=12.84，P=0.012）。特应性哮喘组的ORMDL3基因表达水平与血清IL-17（r=0.318，P=0.000）、血清ECP（r=0.540，P=0.000）均呈正相关。结论不同临床类型的哮喘患儿血清中的ORMDL3基因表达水平、IL-17和ECP含量不同。特应性哮喘患儿的血清ORMDL3基因表达水平与血清IL-17、ECP含量存在正相关性。

反复喘息；特应性哮喘；非特应性哮喘；黏蛋白1样蛋白3基因

气管哮喘为慢性炎症基础上的非特异性呼吸道过敏性反应，支气管平滑肌在乙酰胆碱以及组胺等刺激下发生痉挛。长期的支气管哮喘可导致患者出现血氧饱和度的下降、动脉管壁的慢性内皮损伤以及肺动脉高压等疾病发生率增加[1]。儿童喘息多为过敏性以及体内免疫系统紊乱导致的局部黏膜上皮的炎症性改变，虽然临床上尚未达到支气管哮喘的诊断标准，但英国自然科学杂志对于大样本量的反复喘息性儿童患者进行长期随访研究，发现15%未经过特殊治疗的儿童可进展为支气管哮喘而需要特殊干预[2-3]。血清类黏蛋白1样蛋白3（orosomucoid 1-like protein 3，ORMDL3）是近年来研究较多的血清学指标，其对于局部免疫源性蛋白的四级折叠以及神经鞘脂等的修饰作用，可以影响到相关炎症因子的表达和调控，该调控能力与ORMDL3的基因多态性有关，研究表明，ORMDL3基因与儿童哮喘相关的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）高度相关，但在不同的人群有差异，如欧美人的SNP为rs4378650和rs12603332，日本人的SNP为rs7216389，香港人的SNP为rs4379650。本课题的预实验显示，本院收治＜3岁反复喘息儿童的ORMDL3基因的rs7216389位点的GG、AG和AA基因型或与反复喘息发病相关，本研究在进一步验证的同时，探讨ORMDL3存在形式为蛋白时，与外周血的白介素17（interleukin-17，IL-17）及嗜酸性细胞阳离子蛋白（eosinophil cationic protein，ECP）的相关性及病理意义，为理清＜3岁反复喘息儿童的病理变化和制定治疗方案提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年5月-2017年4月本院儿科就诊的＜3岁反复哮喘的患儿87例，根据患儿是否有高危因素（是否患有过敏性疾病或父母的哮喘病史）分成两组，有高危因素的为特应性哮喘组和无高危因素的为非特应性哮喘组，再选取同期在儿科体检的健康儿童30例作为对照组。特应性哮喘组64例患者。其中，男性39例，女性27例；年龄6个月～3岁，平均（1.28±0.27）岁；平均体重（14.65±5.34）kg；平均身高（101.31±8.84）cm。非特应性哮喘组23例患者。其中，男性13例，女性10例；年龄6个月～2岁9个月，平均（1.47±0.37）岁；平均体重（15.06± 4.97）kg；平均身高（103.26±9.34）cm。对照组30例患者。其中，男性18例，女性12例；年龄8个月～2岁10个月，平均（1.41±0.29）岁；平均体重（15.39± 6.44）kg；平均身高（99.57±9.66）cm。3组患儿的年龄、性别、体重及身高差异无统计学意义（P＞0.05）。所有受试对象的家长均签署知情同意书。

1.2 纳入或排除标准

1.2.1 纳入标准 特应性哮喘组：①根据《儿童支气管哮喘诊断与防治指南2008版》诊断的年龄＜3岁，喘息次数＞2次/半年或＞3次/年的患儿；②患儿有包括湿疹、过敏性鼻炎、变应性皮炎或食物过敏等过敏性疾病，或者父母有一方或双方均有哮喘病史；③排除引起喘息的其他疾病。非特应性哮喘组：①根据《儿童支气管哮喘诊断与防治指南2008版》诊断的年龄＜3岁，喘息次数＞2次/半年或＞3次/年的患儿；②患儿无过敏性疾病，或者父母无哮喘病史；③排除引起喘息的其他疾病。对照组：无哮喘病史、过敏性疾病和家族史。

1.2.2 排除标准 ①先天性肺实质、气道发育不全、气道内阻塞、支气管扩张、活动性肺结核及先天性心脏病患者均排除；②未签署知情同意书。

1.3 指标检测

两组患者入院后采取清晨静脉血4ml，2000r/min离心4min分离血清。

1.3.1 免疫发光法和聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测外周血ORMDL3的测序表达 采用免疫发光法检测ORMDL3表达水平。PCR检测：取冷冻保存已裂解的病毒冲洗液，按照10 000r/min的离心速度进行离心分离病毒，每1ml的Trizol试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，进行裂解操作，采用4℃无酶的核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）冲洗液进行洗涤，再次10 000r/min离心5min，得到RNA。混合液在加入莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶之前先70℃干浴3min，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5μl，37℃水浴60min，室温放置5min使其完全溶解，使其逆转录为互补DNA。以β-actin为模版，在反应体系中加入SYBR Green 1染料、上游引物、下游引物及脱氧核糖核苷三磷酸，使得总体积达20μl，上机，反应条件为：93℃预变性2min、93℃变性1min、55℃退火2min，共40个循环。引物设计，ORMDL3正向引物：5'-ATGGGTGTAAATTAATG-3'，反向引物：5'-TACCTGTGCCAAAGTCAA-3'，引物由上海英骏生物科技有限公司合成。采用琼脂糖凝胶回收DNA纯化PCR产物，得到的纯度高，片断完整性和高生物活性。步骤如下：紫外灯投射仪下切下含目的DNA的凝胶，轻轻擦干吸凝胶，置于离心管并称重，加入3个凝胶体积的Buffer DE-A并在75℃的水浴中加热混合10min，再加0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，并加入1个凝胶体积的异丙醇，混合均匀，转移入制备管，离心，弃滤液。将DNA制备管，加入Buffer W2，离心弃滤液。将DNA制备管置于洁净的离心管，在制备膜中央部位加入Eluent，离心洗脱DNA，即得PCR产物，测序分析。

1.3.2 血清IL-17和血清ECP含量 采用QG1020 AH仪（日本Panosonic公司），严格按照说明书进行操作检测血清IL-17含量和血清ECP水平，试剂盒为美国罗氏公司生产。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 13.0统计软件，计量资料用均数±标准差（±s）表示，3组比较用方差分析，两两比较用LSD-t法；百分比、构成比和率比用（%）表示并用χ2检验进行比较；Pearson法行直线相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组外周血的ORMDL3、IL-17和ECP表达比较

特应性哮喘组ORMDL3蛋白表达水平（11.57± 1.96）%，高于非特应性哮喘组（8.31±1.61）%（t=7.149）和对照组（5.07±1.52）%（t=14.029，均P=0.000）；特应性哮喘组血清 IL-17（1 354.46± 873.48）pg/ml，均高于非特应性哮喘组（343.35± 162.36）pg/ml（t=5.498）和对照组（38.49±2.55）pg/ml（t=8.228，均P=0.000）；特应性哮喘组血清ECP（45.65±12.76）μg/L，均高于非特应性哮喘组（10.23±2.93）μg/L（t=13.142）和对照组（3.22± 1.05）μg/L（t=18.132，均P=0.000）。见表1。

2.2 3组ORMDL3基因AA、AG和GG基因型分布比较

特应性哮喘组的ORMDL3基因AA、AG和GG基因型的频率分别为32.81%、40.63%和26.56%；非特应性哮喘组的ORMDL3基因AA、AG和GG基因型的频率分别为21.74%、65.22%和13.04%；对照组的ORMDL3基因AA、AG和GG基因型的频率分别为26.67%、23.33%和50.0%；3组ORMDL3基因型的分布差异有统计学意义（χ2=12.84，P=0.012）。见表2和图1。

表1 3组外周血的ORMDL3、IL-17和ECP表达比较（±s）

表1 3组外周血的ORMDL3、IL-17和ECP表达比较（±s）

注：1）与对照组比较，P＜0.05；2）与非特应性哮喘组比较，P＜0.05

组别ORMDL3/%IL-17（pg/ml）ECP（μg/L）特应性哮喘组（n=64） 11.57±1.961）2）1354.46±873.481）2）45.65±12.761）2）非特应性哮喘组（n=23） 8.31±1.611）343.35±162.361）10.23±2.931）对照组（n=30） 5.07±1.52 38.49±2.55 3.22±1.05 F值 138.425 53.260 248.149 P值 0.000 0.000 0.000

表2 3组ORMDL3基因多态性分布比较 例（%）

图1 ORMDL3基因rs7216389位点基因型AA、AG和GG（箭头标示突变）

2.3 3组ORMDL3和血清IL-17、ECP含量相关性分析

分别对特应性哮喘组、非特应性哮喘组和对照组的ORMDL3基因表达水平与血清IL-17、ECP做Pearson相关分析发现，特应性哮喘组的ORMDL3基因表达水平与血清IL-17（r=0.318，P=0.000）、血清ECP（r=0.540，P=0.000）均呈正相关。见表3和图2。

表3 3组ORMDL3与血清IL-17、ECP含量相关性分析

图2 特应性哮喘组的ORMDL3基因表达水平与血清IL-7、ECP的关系

3 讨论

年龄＜3岁的小儿，体内细胞免疫特别是CD4+T淋巴细胞介导的抗原提呈免疫以及体液免疫调节功能虽然相对完备，但抗体性物质以及Treg T淋巴细胞诱导释放增加，对于外源性过敏原或者呼吸道黏膜的刺激的反应过激，可导致局部免疫调节失衡。虽然喘息在短时间内对于患者的血氧含量以及心血管对于氧的利用能力无明显影响，但长期反复的喘息（如喘息每日持续＞3次，每次10min，持续6个月）可导致呼吸道腺体分泌的自主神经调节异常[4]，约有20%＜3岁小儿发展为临床型支气管哮喘[5]。

导致大量反复喘息患儿未能得到很好的治疗而长期发病的原因在于喘息的病因尚未研究透彻和临床的治疗仅以对症处理为主，对症治疗的根本原因也在于病因尚不明确，可见病因的研究迫在眉睫，目前在基因遗传方面获得了一些有益信息。与喘息临床症状和发病机理类似的哮喘研究显示，MOFFATT等人在2007年首次证实ORMDL3基因多态性与儿童哮喘易感性有关，携带ORMDL3基因变异的儿童的哮喘风险可增加至少60%。国内学者也陆续发现，ORMDL3基因rs7216389位点的多态性与中国儿童哮喘易感相关，那么儿童喘息，尤其＜3岁反复喘息患儿的ORMDL3基因的rs7216389位点是否存在遗传变异，该类研究国内较少人进行。

本研究前期探索性研究显示，与儿童哮喘易感相关的ORMDL3基因rs7216389位点的多态性也可发生在年龄＜3岁的反复喘息患儿，纳入较多样本的结果显示，特异性喘息组患儿的ORMDL3表达高于非特应性哮喘组和对照组，非特应性哮喘组也高于对照组，进一步，特应性哮喘组、非特应性哮喘组和对照组的ORMDL3基因rs7216389位点的AA、AG和GG基因型分布是存在差异，特应性哮喘和非特应性哮喘组的表达为AG、AA和GG依次递减，但对照组为GG、AA和AG依次递减，与非特应性哮喘组比较，特应性哮喘的AG分布略有增高，差异无统计学意义，提示ORMDL3表达诊断喘息的发病程度和评估预后，ORMDL3基因rs7216389位点的变异与年龄＜3岁的患儿喘息易感性相关，类似的结果也可以从文献中搜索到，如XIAO Q等[6]通过动物试验进行肺泡灌洗液的分析，发现ORMDL3基因表达产物ORMDL3蛋白在呼吸道喘息或者哮喘小鼠中的表达具有一定临床特征依赖性，TAVENDALE等[7]发现苏格兰籍的青少年ORMDL3基因的SNP rs7216389与哮喘易感性和病情进展相关，李波等[8]通过荟萃分析（meta）显示欧洲人群ORMDL3基因（rs7216389）多态性与儿童哮喘的易感相关性高于亚洲人群。崔云霞等[9]研究ORMDL3基因SNP位点rs7216389多态性与儿童哮喘易感性的相关性。HALAPI等[10]认为，rs7216389位点多态性与哮喘相关程度与年龄有关，相关性仅限于低龄患儿哮喘，随着年龄的增加，相关性约低，成人哮喘几乎无关。KANG等[11]还发现除位点 rs7216389，还有 rs4065275、rs4794820和rs11650680的多态性与低龄患儿哮喘易感相关，类似的结果甚至还可在动脉粥样硬化患者中体现[12]，提示，ORMDL3基因SNP位点rs7216389多态性可能普遍与炎症反应密切相关。但也有相反结论的报道，如金哲等[13]发现ORMDL3基因SNPs位点rs7216389与北京区域儿童哮喘无关，阳爱梅等[14]研究98例湖南省汉族0～5岁儿童ORMDL3基因rs7216389存在单核苷酸多态性，哮喘组与对照组的基因型及等位基因构成比无差异。本课题结果产生与文献不同的原因，首先是病种有根本的差异，本课题探讨的是反复喘息，金哲等人研究的是哮喘，而且基因变异可能与不同种族间遗传背景的差异有关，基因遗传病在不同人群中存在的哮喘易感基因也可能不同，环境因素也可以影响婴幼儿呼吸道疾病的发生、发展。

IL-17是由辅助性T细胞17（T helper cell 17，Th17）细胞分泌的一种促炎因子，在自身免疫性疾病、变态反应性疾病及炎症反应中发挥作用，在上述疾病患者的肺组织、支气管肺泡灌洗液、痰液及血清中均升高，患者气道高反应性的严重程度与IL-17的表达水平密切相关。嗜酸粒细胞的浸润是支气管病变的重要特征，嗜酸粒细胞胞内有许多蛋白颗粒，ECP是最重要也是研究透彻的一种，对于支气管病变的发作、预后和方案制定具有重要的指导价值。IL-17及ECP是支气管哮喘以及喘息发生的中心性炎症调控因子，研究下显示IL-17及ECP在支气管肺泡灌洗液以及患者的外周血血清中均高于正常对照人群。XIAO等[11，15]学者认为，评估IL-17及ECP的血清学含量的改变可以评估糖皮质激素雾化吸入治疗的效果，并预测远期复发风险。在该基础上，笔者研究ORMDL3表达和外周血IL-17及ECP的关系，结果显示特应性哮喘组的ORMDL3基因表达水平与血清IL-17和ECP均呈正相关，提示ORMDL3基因在反复发生喘息的患儿发病以及预后评估中具有一定的临床价值，原因可能在于ORMDL3蛋白在分泌型免疫球蛋白A（secretory im munoglobulin A，IgA）及局部黏膜免疫蛋白的四级空间结构的折叠、卷曲等修饰上发挥调控作用，ORMDL3基因转录翻译表达的增加也可促进过敏反应Th2淋巴细胞的激活，通过局部募集黏膜上皮的嗜酸性粒细胞进而促进呼吸道的炎症反应[16-17]。TORTORA等[18-19]学者在分析小儿喘息发生的机制时，基于高危临床因素进行炎症因子或者信号通路蛋白表达的分析，提出特异性抗体介导治疗的新思路。TORTORA的提法也为大家一些启示，通过分析ORMDL3基因的调控途径或可成为免疫治疗提供参考。

综上所述，ORMDL3基因在＜3岁反复发生喘息患儿体内异常扩增，其等位基因的突变可能促进患儿喘息的发生、发展，同时ORMDL3基因与IL-17以及ECP等血清炎症因子具有一定的关系，ORMDL3基因的调控途径或可为小儿3岁反复发生喘息患儿的治疗提供帮助。

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Surum expression ofORMDL3gene and its relationships with IL-17 and ECT in recurrent wheezing patients under 3 years

Hong Zheng,Wei Wang,Zhao He,Jin-bao Liu,Jian Zhong
(Department of Pediatrics,the First People's Hospital of Huizhou, Huizhou,Guangdong 516000,China)

ObjectiveTo investigate the expression of orosomucoid 1-like protein 3 (ORMDL3)gene of different clinical phenotypes and its relationship between seruminterleukin-17(IL-17),serum eosinophil cationic protein(ECP)in peripheral blood of the recurrent asthma patients no more than 3 years old.MethodsEighty recurrent asthma children no more than 3 years old admitted to our hospital were selected and divided into atopic asthma group (64 cases)and non-atopic asthma group (23 cases)according to the existence of high risk factors.In the same period 30 cases of healthy children were selected in the control group.The differences ofORMDL3gene expression,serum IL-17,serum ECP,andORMDL3gene frequency distribution in the three groups were analyzed,and the correlations ofORMDL3gene expression level with serum IL-17 content,serum ECP content in the 3 groups were analyzed.ResultsThe expression levels ofORMDL3gene (1354.46±873.48)pg/ml and serum ECP content (45.65±12.76)μg/L in the atopic asthma group were higher than those in the non-atopic asthma group and the control group(P=0.000).The distribution of AA,AG and GG genotypes ofORMDL3had no significant difference among the 3 groups (χ2=12.84,P=0.012).The expression levels ofORMDL3gene was positively related with serum IL-7 (r=0.318,P=0.000)and serum Eop (r=0.540,P=0.000)in the atopic group.ConclusionsThe serum expression levels ofORMDL3gene,ECP and IL-17 are different among asthma children with different clinical phenotypes.The expression level of ORMDL3gene in the serum of atopic asthma patients no more than 3 years old is related to the levels of serum IL-17 and ECP.

recurrent asthma;atopic asthma;non-atopic asthma;orosomucoid 1-like protein 3 gene

R725

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.18.006

1005-8982（2017）18-0032-06

2016-06-08