miR-29a在宫颈癌组织中的表达及其上调后对宫颈癌细胞恶性生物学行为的影响

黄智述，任黔川

（1.西南医科大学，四川 泸州 646000；2.西南医科大学附属医院 妇产科，四川 泸州 646000）

临床研究·论著

miR-29a在宫颈癌组织中的表达及其上调后对宫颈癌细胞恶性生物学行为的影响

黄智述1，任黔川2

（1.西南医科大学，四川 泸州 646000；2.西南医科大学附属医院 妇产科，四川 泸州 646000）

目的检测微小RNA（miR）-29a在宫颈癌组织和不同种类宫颈癌细胞系中的表达情况及其上调后对宫颈癌SiHa细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移等恶性生物学行为的影响。方法①组织标本检测：收集2014年7月-2016年7月西南医科大学附属医院活检或手术切除的宫颈组织标本160例，采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测miR-29a的表达情况，并分析宫颈癌组织中miR-29a的表达与临床病理特征的关系。②细胞学实验：采用qRT-PCR检测miR-29a在不同种类的人宫颈癌细胞系（SiHa、HeLa、Caski及C33a）和人正常宫颈细胞系Ect1/E6E7中的表达水平，选取miR-29a表达最低的宫颈癌细胞系SiHa进行后续研究，使用miR-29a mimics转染SiHa细胞，qRT-PCR检测转染后细胞miR-29a的表达变化，CCK-8法检测转染后细胞增殖活力的变化，流式细胞仪检测转染后细胞凋亡率的变化，Transwell实验检测转染后细胞迁移和侵袭能力的变化。结果宫颈鳞癌组织中miR-29a表达低于HSIL、LSIL及正常宫颈组织（P＜0.05）；HSIL组织中miR-29a表达低于LSIL及正常宫颈组织（P＜0.05），LSIL与正常宫颈组织间miR-29a的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。宫颈鳞癌组织中miR-29a的表达与患者临床分期和淋巴结转移密切相关（P＜0.05）。miR-29a在人宫颈癌细胞系（SiHa、HeLa、Caski和C33a）中的表达低于人正常宫颈细胞系Ect1/E6E7（P＜0.05）。SiHa细胞转染miR-29a mimics后，miR-29a表达水平增高（P＜0.05），细胞增殖活力降低（P＜0.05），细胞凋亡率增高（P＜0.05），细胞迁移和侵袭能力下降（P＜0.05）。结论miR-29a在宫颈癌组织和细胞中均呈低表达，上调miR-29a的表达能够抑制宫颈癌SiHa细胞的增殖及侵袭迁移能力，促进细胞的凋亡。

miR-29a；子宫颈癌；SiHa细胞

宫颈癌是女性常见妇科恶性肿瘤之一，在世界范围内，宫颈癌的发病率和病死率已居于女性生殖系统恶性肿瘤首位[1]，并且近年来呈年轻化趋势[2]。根治性手术和放化疗是目前宫颈癌的主要治疗方式，但由治疗产生的不良反应严重影响患者的生命质量。因此，从分子水平探讨宫颈癌的发生机制，寻找临床治疗宫颈癌有效的基因靶点迫在眉睫。microRNA是一组内源性、长度在18～25个核苷酸非编码蛋白质的单链RNA，其可以通过与靶基因mRNA的3’-UTR区结合调节靶基因的表达，参与机体炎症反应、免疫应答、细胞增殖及凋亡等生理病理过程[3-4]。目前研究显示，微小RNA-29a（miR-29a）在多种人类恶性肿瘤组织中起着促癌基因或者抑癌基因的作用[5-7]，但至今为止，miR-29a在宫颈癌方面的研究国内外甚少。本研究检测miR-29a在宫颈癌组织和宫颈癌细胞系中的表达并分析上调miR-29a表达对宫颈癌SiHa细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移等恶性生物学行为的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织标本 选取2014年7月-2016年7月在西南医科大学附属医院妇产科门诊活检或手术切除的宫颈组织标本共160例。其中，宫颈鳞癌标本80例，宫颈高级别鳞状上皮内病变（high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL）标本40例，宫颈低级别鳞状上皮内病变（low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）标本20例，正常宫颈组织标本20例。标本取出后立即放入液氮中，置入-80℃冰箱冷冻保存。所有患者活检或术前均未行放化疗等治疗，全部病理切片经过西南医科大学附属医院病理科专家复阅确诊。宫颈癌患者临床分期采用国际妇产科联盟（FIGO）的分期标准，Ⅰ期35例，Ⅱ期45例；病理分级：G119例，G239例，G322例；有淋巴结转移23例，无淋巴结转移者57例。本研究所有患者均签署知情同意书并经医院伦理委员会批准。

1.1.2 细胞系 人宫颈癌细胞系（SiHa、HeLa、Caski和C33a）和人正常宫颈细胞株Ect1/E6E7（购自中国科学院上海细胞库），用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养，置于37℃含5%二氧化碳CO2的培养箱中。

1.1.3 主要试剂 miR-29a mimics及阴性对照mimics-NC（均购自上海吉玛制药技术公司），Trizol试剂和LipofectamineTM2000（购自美国Invitrogen公司），RNA逆转录试剂盒及实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）试剂盒（购自日本TaKaRa公司），miR-29a及内参U6引物由广州锐博生物公司设计合成，Cell counting Kit-WST-8（CCK-8）试剂盒（购自上海东仁公司），Annexin V-FITC/PI双染凋亡检测试剂盒（购自南京凯基生物公司），Transwell小室（购自美国Corning公司），基质胶（购自美国BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞转染 将对数生长期的SiHa细胞接种于6孔板中，常规条件培养，融合度达到50%～60%时进行细胞转染，按照LipofectamineTM2000试剂盒说明书进行转染操作，实验组每孔加入100 pmol miR-29a mimics及5μl转染试剂，对照组每孔加入100pmol mimics-NC及5μl转染试剂，转染后qRTPCR检测 miR-29a的表达，确定转染效果再进行体外细胞实验。

1.2.2 qRT-PCR法检测组织和细胞中miR-29a的表达 Trizol法提取组织或细胞总RNA，超微量分光光度计测RNA浓度，严格按试剂盒说明书逆转录反应合成cDNA，反应条件：37℃水溶60min，95℃干溶5min。取逆转录产物为模板，利用定量PCR试剂盒、miR-29a及内参U6特异性引物进行qRT-PCR检测，反应条件：95℃预变性15min，94℃变性20 s，55℃退火30 s，72℃延伸30s，扩增45个循环。以U6作为内参基因，2-△△Ct法计算miR-29a相对表达量，实验重复3次。

1.2.3 CCK-8实验检测细胞增殖 活力细胞接种于96孔板，常规条件培养，融合度达到50%～60%时进行细胞转染，分别于转染后24、48、72及96 h取出培养箱，参照CCK-8试剂盒操作说明书操作向每孔加入10μl CCK-8溶液，37℃避光孵育1h后用酶标仪测定波长450 nm处的各孔对应的吸光度值，每组设5个复孔。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡率 上述转染细胞于48 h后，用不含EDTA的胰酶消化后离心收集细胞，PBS洗涤细胞，离心弃上清液，调整细胞浓度为（1～5）×105个/ml，加入Annexin V-FITC和碘化丙啶（PI）染色，室温避光孵育15min后进行流式细胞仪检测，计算细胞凋亡百分比，实验重复3次。

1.2.5 Transwell体外迁移和侵袭实验检测细胞的迁移和侵袭能力 上述细胞转染后24 h，胰蛋白酶消化收集细胞，用无血清培液对各组细胞进行饥饿处理，Transwell小室膜水化预处理后，向上室每孔加入含2×105个细胞的细胞悬液，下层加入含10%FBS的完全培养基，置培养箱继续培养24 h后取出小室，棉签小心擦去上室表面未迁移的细胞，固定、染色，显微镜下观察、拍照，随机选取显微镜下选5个视野，计数穿出细胞数，取平均数，实验重复3次。侵袭实验时，将Transwell小室进行包被基质膜处理，用基质胶包被Transwell小室基底膜，待基质胶凝固后进行后续实验，之后的实验步骤同迁移实验。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用单因素方差分析或重复测量设计的方差分析，计数资料以率（%）表示并行χ2检验，两两比较用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈鳞癌、HSIL、LSIL及正常宫颈组织中miR-29a的相对表达量

经qRT-PCR检测宫颈鳞癌、HSIL、LSIL及正常宫颈组织中miR-29a的表达水平，组间整体比较差异有统计学意义（F=1394.78，P=0.000）；进一步多重比较结果显示，LSIL及正常宫颈组织中miR-29a的表达水平比较差异无统计学意义（P＜0.05），宫颈鳞癌和HSIL组织中miR-29a表达低于LSIL及正常宫颈组织（P＜0.05），且宫颈癌组织中miR-29a表达低于HSIL组织（P＜0.05）。见图1。

2.2 miR-29a表达与宫颈鳞癌临床病理特征的相关性分析

以宫颈鳞癌组织miR-29a均值水平为临界值，分为miR-29a高表达和miR-29a低表达，与患者年龄、肿瘤直径、病理分级、间质浸润深度、临床分期及有无淋巴转移等临床病理特征的相关性进行统计学分析，结果表明，宫颈鳞癌组织中miR-29a的低表达与临床分期和淋巴结转移相关（P＜0.05），提示低表达的miR-29a可能参与肿瘤的发展及转移过程。见附表。

2.3 各细胞系miR-29a的相对表达量

图1 宫颈组织中miR-29a的相对表达

附表 不同临床病理特征与宫颈鳞癌miR-29a低表达率关系

经qRT-PCR检测，miR-29a在正常宫颈细胞系Ect1/E6E7和宫颈癌细胞系（SiHa、HeLa、Caski及C33a）组间整体差异有统计学意义（F=155.33，P=0.000）；进一步多重比较结果显示，宫颈癌细胞系（SiHa、HeLa、 Caski及C33a）中miR-29a的表达水平较正常宫颈细胞系Ect1/E6E7均降低（P＜0.05）（见图2）。其中，SiHa细胞系相对表达最低，因此选择SiHa细胞系作为后续实验的研究对象，SiHa细胞转染miR-29a mimics，经qRT-PCR证实，miR-29a在miR-29a mimics组、mimics-NC组和空白对照组3组间整体差异有统计学意义（F=1798.47，P=0.000）；进一步多重比较结果显示，miR-29a mimics组中miR-29a的表达水平高于mimics-NC组和空白对照组（P＜0.05），提示转染miR-29a mimics可上调SiHa细胞miR-29a的表达水平（P＜0.05），证明转染效率较高。见图3。

2.4 上调miR-29a的表达抑制SiHa细胞的增殖

将miR-29a mimics组和mimics-NC组SiHa细胞于转染后24、48、72及96 h时进行CCK-8增殖实验，采用重复测量设计的方差分析，结果显示：①转染后不同时间的细胞增殖比较，差异有统计学意义（F=6.489，P=0.000）；②miR-29a mimics组和mim ics-NC组细胞增殖情况比较，差异有统计学意义（F=10.559，P=0.000）；③miR-29a mimics组和mimics-NC组细胞增殖的变化趋势比较，差异有统计学意义（F=5.148，P=0.000）。见图4。

图2 miR-29a在正常宫颈细胞系与宫颈癌细胞系中的相对表达

图3 各组SiHa细胞中miR-29a的相对表达

图4 转染miR-29a mimics对SiHa细胞增殖活力的影响

2.5 上调miR-29a的表达促进SiHa细胞的凋亡

流式细胞术结果显示，miR-29a mimics组SiHa细胞的凋亡率高于mimics-NC组细胞（t=11.364，P=0.000），提示上调miR-29a的表达能够促进SiHa细胞的凋亡。见图5。

2.6 上调miR-29a的表达抑制SiHa细胞的迁移及侵袭能力

Transwell迁移实验检测上调miR-29a后SiHa细胞迁移能力的变化，miR-29a mimics组和mimics-NC组细胞穿入下层小室的细胞数目分别为：（112±10）和（202±18）个/HP，miR-29a mimics组穿膜细胞数少于mimics-NC组（t=7.570，P=0.002），表明上调miR-29a的表达能够抑制SiHa细胞的迁移能力。Transwell侵袭实验检测上调miR-29a后SiHa细胞侵袭能力的变化，结果表明，miR-29a mimics组和mimics-NC组细胞穿入下层小室的细胞数目分别为（86±8）和（184±16）个/HP，miR-29a mimics组穿膜细胞数少于mimics-NC组（t=9.489，P=0.001），表明上调miR-29a的表达能够抑制SiHa细胞的侵袭能力。见图6。

图5 转染miR-29a mimics对SiHa细胞凋亡率的影响

图6 转染miR-29a mimics对SiHa细胞迁移和侵袭能力的影响

3 讨论

在人类复杂的基因调控网络中miRNA起着极其重要的作用，miRNA在转录后水平调节基因的表达，参与肿瘤细胞的增殖、凋亡及侵袭和迁移，参与恶性肿瘤的发生、发展[8-9]。miR-29a是miR-29家族成员之一，其定位于人染色体7q32.3的负链，其在人类的脑及心脏组织中高表达，在机体免疫反应、肿瘤形成等生理病理过程中发挥重要作用[10]。miR-29家族主要包括miR-29a、miR-29b及miR-29c 3个成员。目前，miR-29a与肿瘤关系的研究较少，并且作用机制尚不完全明确。近期逐渐增多的研究表明miR-29a在恶性肿瘤组织中表达减低，提示miR-29a的低表达可能参与恶性肿瘤的发生、发展。MUNIYAPPA等[11]在研究中发现miR-29a在侵袭性肺癌细胞中表达降低，上调miR-29a的表达可以抑制其侵袭能力。XU等[12]通过qRT-PCR发现miR-29a在多种实体恶性肿瘤中表达降低。WU等[5]在研究中证实miR-29a在乳腺癌组织及细胞中表达水平下降，miR-29a可以靶向调控B-Myb基因抑制肿瘤细胞的增殖。本研究发现，在不同的宫颈病变组织中表达水平有差异，随着子宫颈病变由正常宫颈和LSIL逐步向HSIL和宫颈癌演变的过程中，miR-29a的表达水平逐步减低，miR-29a在正常宫颈和LSIL组织中表达水平相对较高，而在宫颈鳞癌及HSIL组织中呈低表达，且miR-29a在宫颈鳞癌组织中的表达低于HSIL，随后笔者进一步对正常宫颈细胞系和宫颈癌细胞系检测发现miR-29a在宫颈癌细胞系中的表达低于正常宫颈细胞系，因此推测miR-29a的表达缺失可能与宫颈癌的发生、发展有关。目前研究已证实，在儿童急性髓细胞白血病中，miR-29a的表达水平越低，临床分期越晚，预后越差[13]。在大肠癌中，低水平的miR-29a提示癌症的分级高，预后差[14]。本研究进一步统计分析发现宫颈癌组织中miR-29a的表达与患者的临床分期和淋巴结转移相关，低水平的miR-29a提示患者较晚的分期及淋巴结转移的可能。

肿瘤患者90%死于转移[15]，肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭及转移等恶性生物学行为是肿瘤进展、影响患者生存期的重要原因。本研究细胞学试验证实上调miR-29a的表达能抑制肿瘤细胞的增殖活力，增高肿瘤细胞的凋亡率，并且降低肿瘤细胞的迁移和侵袭能力，提示miR-29a在宫颈癌中属于抑癌基因，有望成为临床治疗宫颈癌的基因靶点。有关miR-29a调控肿瘤细胞恶性生物学行为的具体分子生物学机制尚不明确。目前研究表明，miR-29a能够抑制NF-KB信号通路[16]，直接抑制DNA甲基转移酶活性[17]，诱导肿瘤细胞凋亡。GEBESHUBER等[18]在研究中还发现，miR-29a能够通过抑制锌脂蛋白36的表达抑制肿瘤的EMT过程。目前，miR29a在宫颈癌中调控其恶性生物学行为的具体机制还缺乏充分的解释，尚需要在更进一步的研究阐明。

综述所述，miR-29a在宫颈癌中的表达水平降低，可作为宫颈癌进展的有效分子指标，上调miR-29a的表达能够抑制宫颈癌细胞的增殖及侵袭迁移能力，促进细胞的凋亡，为宫颈癌的发病机制及临床诊疗提供新的思路。

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Expression of miR-29a in cervical cancer and effect of miR-29a up-regulation on malignant biologic behaviors of cervical cancer cells

Zhi-shu Huang1,Qian-chuan Ren2
(1.Southwest Medical University,Luzhou,Sichuan 646000,China;2.Department of Gynaecology and Obstetrics,the Affiliated Hospital of Southwest Medical University,Luzhou,Sichuan 646000,China)

ObjectiveTo investigate the expression of miR-29a in specimens and cells of cervical cancer and explore the effect of up-regulafion of miR-29a expression on proliferation,apoptosis,invasion and migration of cervical cancer cells further.MethodsTotally 160 cases of biopsy or surgical specimens were collected in the Affiliated Hospital of Southwest Medical University from July 2014 to July 2016,including 80 cases of cervical cancer,40 cases of high-grade squamous intraepithelial lesion(HSIL),20 cases of low-grade squamous intraepithelial lesion (LSIL)and 20 cases of normal cenix.The expression levels of miR-29a indifferent cervical tissues were examined by qRT-PCR.The correlations of miR-29a expression with the clinicopathological parameters of patients were analyzed.The expressions of miR-29a in four cervical cancer cell lines (SiHa,HeLa,Caski,C33a)and one normal cervical cell line Ect1/E6E7 were also examined by qRT-PCR.SiHa cells with the lowest expression of miR-29a were selected in the follow-up studies.SiHa cells were transfected with miR-29a mimics,and the expression of miR-29a in transfected cells was detected by qRT-PCR.CCK-8 assay,flowcytometry and Transwell assay were used to analyze the effect of miR-29a mimics on the proliferation,apoptosis,invasion and migration of SiHa cells.ResultsThe expression of miR-29a in cervical squamous cancer was lower than that in HSIL,LSIL and normal cervical tissue(P＜0.05),and the expression of miR-29a in HSIL was lower than that in LSIL and normal cervical tissue(P＜0.05),while there was no significant difference between LSIL and normal cervical tissues (P＞0.05).The expression level of miR-29a in cervical squamous cancer was correlated with clinical stage and lymph node metastasis (P＜0.05).The expression of miR-29a in cervical cancer cell lines was lower than that in normal cervical cell line(P＜0.05).After transfection with miR-29a mimics,the expression of miR-29a was significantly increased (P＜0.05),the proliferation activity was significantly decreased (P＜0.05),the apoptosis rate was significantly increased(P＜0.05),and the cell migration and invasion abilities in SiHa cells were significantly decreased(P＜0.05).ConclusionsThe expression of miR-29a significantly decreases in cervical cancer tissues and cells. Up-regulation of miR-29a can inhibit proliferation,migration and invasion,and promote apoptosis in SiHa cells.

miR-29a;cervical cancer;SiHa cell

R737.33

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.18.004

1005-8982（2017）18-0022-06

2017-01-25

任黔川，E-mail：tyl_wf@yeah.net