MMP-9在颅内动脉瘤组织中的表达变化及其对血管平滑肌细胞凋亡的影响

刘明辉

(德州市市立医院，山东德州253012)

MMP-9在颅内动脉瘤组织中的表达变化及其对血管平滑肌细胞凋亡的影响

刘明辉

(德州市市立医院，山东德州253012)

目的 观察基质金属蛋白酶9(MMP-9)在颅内动脉瘤组织中的表达变化及其对血管平滑肌细胞凋亡的影响。方法 收集新鲜颅内动脉瘤组织20例份、正常颅内动脉血管组织10例份，采用Western blotting法检测MMP-9蛋白表达。分离培养颅内动脉瘤血管平滑肌细胞，随机分为MMP-9 siRNA组、siRNA对照组、空白对照组，分别加入MMP-9 siRNA、对照序列siRNA、转染试剂培养48 h，采用Western blotting法检测各组MMP-9及Bcl-2、Bax、p65、p-p65蛋白表达，流式细胞术检测各组细胞凋亡率。结果 颅内动脉瘤组织MMP-9蛋白相对表达量明显高于正常颅内动脉血管组织(P<0.01)。与空白对照组、siRNA对照组比较，MMP-9 siRNA组MMP-9及Bax、p-p65蛋白相对表达量降低，Bcl-2蛋白相对表达量升高(P均<0.01)，p65蛋白相对表达量未见明显变化(P>0.05)，而siRNA对照组与空白对照组各指标比较P均>0.05。MMP-9 siRNA组细胞凋亡率明显低于siRNA对照组、空白对照组(P均<0.01)，而siRNA对照组与空白对照组比较P>0.05。结论 MMP-9在颅内动脉瘤组织中呈高表达。下调MMP-9蛋白表达能抑制颅内动脉瘤血管平滑肌细胞凋亡，其机制可能与NF-κB信号通路活性降低有关。

颅内动脉瘤；基质金属蛋白酶9；血管平滑肌细胞；细胞凋亡

颅内动脉瘤是由颅内动脉内腔局限性异常扩张所致动脉壁的一种瘤状突起，是临床常见的血管性疾病，是自发性蛛网膜下腔出血最常见的原因[1]。颅内动脉瘤的发病原因尚不十分清楚，其治疗主要以血管内栓塞及手术治疗为主，但临床效果并不理想[2]。基质金属蛋白酶(MMPs)由多种细胞，如平滑肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞等，以非酶原形式合成及分泌[3]。近年研究发现，MMPs在动脉闭塞、脑卒中等脑血管病中表达升高[4,5]，在颅内动脉瘤中也检测到MMP-9高表达[6]。但目前其在颅内动脉瘤发生、发展中的作用尚不清楚。2014年1月～2015年7月，我们观察了颅内动脉瘤组织中MMP-9的表达变化及其对血管平滑肌细胞凋亡的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 同期选择德州市市立医院手术切除的新鲜颅内动脉瘤组织20例份，患者男16例、女4例，年龄(38.13±10.63)岁。所有患者经数字减影血管显像技术明确诊断，且未累及正常颞浅动脉，排除合并严重肝肾功能损害、心血管系统疾病、其他部位恶性肿瘤及血液系统疾病等。同期另选因颞叶癫痫而切除的颞叶皮层动脉血管组织10例份，经术后组织病理检查为正常动脉组织，患者男15例、女5例，年龄(37.42±6.68)岁。两种组织来源患者性别、年龄具有可比性。

主要仪器及试剂：流式细胞仪，美国BD公司；CO2培养箱，美国Thermo公司；倒置荧光显微镜，日本尼康株式会社；胰蛋白酶、DMEM培养基，美国Gibco公司；青/链霉素双抗，美国Sigma公司；Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司；Lipofectamine2000转染试剂盒，美国Life Technology公司；组织蛋白抽提试剂盒，北京康为世纪生物技术有限公司；MMP-9 siRNA及对照序列siRNA，上海吉玛制药技术有限公司；鼠抗人Bcl-2、Bax、MMP-9单克隆抗体，美国Santa Cruz公司；兔抗人p65、p-p65单克隆抗体，美国Cell Signaling Technology公司；HRP标记的羊抗鼠/兔IgG，美国Abcam公司。

1.2 动脉瘤组织及正常动脉组织MMP-9蛋白表达检测 采用Western blotting法。分别取动脉瘤组织、正常动脉组织各1.5 g，剪碎，液氮下研磨成粉末，组织蛋白抽提试剂冰上孵育20 min，4 ℃ 12 000 r/min离心20 min，收集上清。BCA法蛋白定量后，加入Loading buffer充分混合，100 ℃水浴5 min。取蛋白50 μg行SDS-PAGE，80 V电压电泳30 min，调整电压为120 V至电泳结束。4 ℃下将蛋白转印至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭3 h，加入MMP-9一抗(1∶500)室温孵育2 h，加入HRP标记的羊抗鼠二抗(1∶2 000)室温孵育1 h，ECL显影，自动凝胶成像系统采集图像。以GAPDH蛋白为内参，以目的蛋白电泳条带灰度值与GAPDH蛋白电泳条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

1.3 沉默MMP-9表达对动脉瘤组织血管平滑肌细胞凋亡影响的观察

1.3.1 动脉瘤血管平滑肌细胞分离与鉴定 随机取上述手术切除的新鲜动脉瘤标本1例份，眼科剪剪至1 cm3左右，37 ℃ 0.1% Ⅱ型胶原酶消化，直至瘤体表面出现白色絮状物。取出组织块，剪至约1 mm3，接种于培养瓶中，两块间隔3～5 cm。37 ℃、5% CO2细胞培养箱孵育8 h，待组织块紧贴瓶底生长时，加入DMEM完全培养液。培养24 h，加入1 mL含10% FBS的DMEM培养液继续培养。待细胞爬出第5天，去除组织块，加入3 mL含10% FBS的DMEM完全培养液，每24 h换液一次。待细胞生长至90%融合时传代。取传3代血管平滑肌细胞，接种于事先放置盖玻片的细胞培养皿上，37 ℃、5% CO2细胞培养箱培养3天。待细胞融合达80%时，取出盖玻片，PBS清洗，4%多聚甲醛固定，晾干后用α-肌动蛋白抗体室温下孵育2 h，Alexa Fluor®488 AffiniPure羊抗鼠二抗室温孵育1 h，荧光显微镜下观察到大量标记绿色荧光的细胞，即为血管平滑肌细胞。

1.3.2 下调血管平滑肌细胞MMP-9蛋白表达及效率 取传3代对数生长期血管平滑肌细胞，制成密度为5×105个/mL的细胞悬液。取细胞悬液接种于6孔板，每孔2 mL，置于细胞培养箱中培养24 h。待细胞融合至75%时，将培养液更换为不含FBS的培养液，37 ℃孵育1 h。取出细胞，随机分为空白对照组、siRNA对照组、MMP-9 siRNA组。siRNA对照组、MMP-9 siRNA组分别加入对照序列siRNA及MMP-9 siRNA，空白对照组只加转染试剂。每组设6个复孔。不完全培养液培养6 h，换用完全培养液继续培养48 h。收集各组细胞，采用Western blotting法检测MMP-9蛋白相对表达量。结果显示，MMP-9 siRNA组、siRNA对照组、空白对照组MMP-9蛋白相对表达量分别为0.196±0.02、0.432±0.01、0.439±0.04。MMP-9 siRNA组MMP-9蛋白相对表达量明显低于siRNA对照组、空白对照组(P均<0.01)。

1.3.3 血管平滑肌细胞凋亡检测 采用流式细胞术。收集各组转染48 h细胞，制成密度为2×106个/mL的细胞悬液。分别取细胞悬液1 mL，500×g离心10 min，收集沉淀；PBS清洗2次，加入500 μL结合缓冲液重悬细胞，再分别加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI混匀，室温避光孵育15 min。流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

1.3.4 血管平滑肌细胞Bcl-2、Bax、p65、p-p65蛋白表达检测 采用Western blotting法。收集各组细胞，加入NP40细胞裂解液100 μL，冰上充分裂解30 min，4 ℃ 12 000 r/min离心20 min，收集上清。BCA法蛋白定量后，加入Loading buffer充分混合，100 ℃水浴5 min。取蛋白50 μg行SDS-PAGE，80 V电压电泳30 min，调整电压为120 V至电泳结束。4 ℃下将蛋白转印至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭3 h，加入Bcl-2(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、p65(1∶1 000)、p-p65(1∶1 000)一抗室温孵育2 h，然后加入HRP标记的羊抗鼠/兔二抗(1∶2 000)，室温孵育1 h，ECL发光、显影，自动凝胶成像系统采集图像。以GAPDH蛋白为内参，以目的蛋白电泳条带灰度值与GAPDH蛋白电泳条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 颅内动脉瘤组织及正常颅内动脉血管组织MMP-9蛋白表达比较 颅内动脉瘤组织MMP-9蛋白相对表达量为0.17±0.04，正常颅内动脉血管组织为0.43±0.06，二者比较P<0.01。

2.2 各组细胞凋亡率比较 MMP-9 siRNA组细胞凋亡率为(12.2±5.0)%，siRNA对照组为(28.6±8.0)%，空白对照组为(29.3±3.0)%。MMP-9 siRNA组细胞凋亡率明显低于siRNA对照组、空白对照组(P均<0.01)，而siRNA对照组与空白对照组比较P>0.05。

2.3 各组Bcl-2、Bax、p65、p-p65蛋白表达比较 见表1。

表1 各组Bcl-2、Bax、p65、p-p65蛋白相对表达量比较±s)

注：与空白对照组比较，*P<0.01；与siRNA对照组比较，#P<0.01。

3 讨论

MMP-9是一种明胶酶类基质金属蛋白酶，通过作用于Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型胶原及明胶、弹性纤维等，降解细胞外基质。有研究表明，MMP-9等基质金属蛋白酶在动脉瘤形成过程中具有重要作用[7，8]。本研究结果显示，颅内动脉瘤组织MMP-9蛋白表达明显高于正常颅内动脉血管组织，说明MMP-9过表达可能参与颅内动脉瘤形成。细胞外基质是构成血管壁的重要成分[9]。MMP-9过表达能破坏细胞外基质，削弱或破坏动脉管壁的完整性，从而参与动脉瘤的形成和破裂[10]。本研究利用MMP-9特异性siRNA下调MMP-9蛋白表达，进一步研究MMP-9在动脉瘤形成中的作用。结果显示，MMP-9 siRNA组细胞凋亡率明显低于siRNA对照组、空白对照组，证实下调MMP-9蛋白表达可抑制血管平滑肌细胞凋亡，可能有助于抑制动脉瘤形成。

细胞凋亡是由凋亡相关基因调控的细胞主动性死亡。Bcl-2蛋白家族是调节细胞凋亡的主要基因[11]。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族最重要的两个成员[12]。Bcl-2是一种生存蛋白，可抑制细胞凋亡[13]；Bax是一种凋亡蛋白，对细胞凋亡具有促进作用[14]。二者在细胞中常以同源或异源二聚体形式存在，当细胞内Bcl-2含量增多时，Bcl-2/Bax二聚体含量增多，凋亡受到抑制；当Bax含量增加时，Bax自身形成同源二聚体，可促进细胞凋亡[15]。本研究结果显示，下调MMP-9蛋白表达后，Bax表达下降，而Bcl-2表达升高。表明抑制MMP-9能上调Bcl-2表达、下调Bax表达，继而抑制血管平滑肌细胞凋亡。

NF-κB是一类NF-κB/Rel蛋白家族的细胞核转录因子，广泛存在于多种组织细胞中，其靶基因主要参与调控宿主的应激反应、免疫反应以及细胞增殖与凋亡[16]。NF-κB信号通路可参与多种凋亡相关基因的转录调控，具有促进细胞凋亡和抑制细胞凋亡的双重作用[17]。在黑色素瘤和肺癌等多种肿瘤中，NF-κB能促进MMP-9基因表达[18,19]。但MMP-9-NF-κB信号通路在血管平滑肌细胞凋亡中的作用鲜见报道。本研究结果显示，下调MMP-9蛋白表达后，p65表达没有显著变化，而p-p65表达下降。表明下调MMP-9蛋白表达可降低NF-κB信号通路活性。

综上所述，MMP-9在颅内动脉瘤组织中高表达。下调MMP-9蛋白表达能抑制颅内动脉瘤血管平滑肌细胞凋亡，其机制可能与NF-κB信号通路活性降低有关。

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