右美托咪定辅助氯胺酮麻醉对大鼠海马区神经细胞的保护作用

姜卫荣，徐艳冰，王金波

(1 山东省医学科学院附属医院，济南250031；2 山东省立医院)

右美托咪定辅助氯胺酮麻醉对大鼠海马区神经细胞的保护作用

姜卫荣1，徐艳冰2，王金波1

(1 山东省医学科学院附属医院，济南250031；2 山东省立医院)

目的 探讨右美托咪定辅助氯胺酮麻醉对大鼠海马区神经细胞的保护作用。方法 将32只SD大鼠按照随机数字表法分为空白对照组、氯胺酮组、右美托咪定组和联合用药组，每组8只。空白对照组腹腔注射生理盐水50 mL/kg，间隔5 min皮下注射生理盐水50 mL/kg；氯胺酮组腹腔注射氯胺酮70 mg/kg，间隔5 min皮下注射生理盐水50 mL/kg；右美托咪定组腹腔注射右美托咪定25 μg/kg，间隔5 min皮下注射生理盐水50 mL/kg；联合用药组腹腔注射氯胺酮70 mg/kg，间隔5 min皮下注射右美托咪定25 μg/kg；各组均每天注射1次，连续注射3天。各组随机取4只，检测首次注射即刻(t0)及末次注射15、30、45、60、75、90 min(t1～t6)呼吸频率、翻正反射消失时间、翻正反射消失持续时间以及夹尾反射完全消失时间，Morris水迷宫实验检测各组训练1～5天的逃避潜伏期。各组剩余大鼠末次注射结束，断头处死，TUNEL法检测海马区神经细胞凋亡率，Western blotting法检测PKC、ERK1/2、Bcl-2蛋白表达。结果 与联合用药组比较，氯胺酮组翻正反射消失时间明显延长，镇静维持时间、翻正反射消失持续时间明显缩短，两组比较P均<0.05。t1、t2、t3时，氯胺酮组呼吸频率均显著高于空白对照组、右美托咪定组和联合用药组同时间(P均<0.05)。空白对照组、右美托咪定组、联合用药组各时间逃避潜伏期比较P均>0.05；训练第4、5天，氯胺酮组逃避潜伏期较空白对照组、右美托咪定组和联合用药组明显延长(P均<0.05)。氯胺酮组神经细胞凋亡率明显高于空白对照组、右美托咪定组和联合用药组(P均<0.05)，而空白对照组、右美托咪定组和联合用药组神经细胞凋亡率比较P均>0.05。氯胺酮组海马区PKC、ERK1/2、Bcl-2蛋白表达明显低于空白对照组、右美托咪定组和联合用药组(P均<0.05)，而空白对照组、右美托咪定组和联合用药组海马区PKC、ERK1/2、Bcl-2蛋白表达比较P均>0.05。结论 右美托咪定辅助氯胺酮麻醉对大鼠海马区神经细胞凋亡具有保护作用，其作用机制可能与激活PKC-ERK1/2-Bcl-2信号通路有关。

麻醉；右美托咪定；氯胺酮；细胞凋亡；记忆功能；抗凋亡信号通路；大鼠

氯胺酮是临床常用的麻醉剂，具有镇痛效果强、起效快、呼吸抑制作用弱等优点，广泛应用于小手术或诊断性操作时的浅表麻醉[1]。有研究发现，氯胺酮能够增加腺体分泌并可兴奋心脏，导致呼吸负担和心脏负荷加重，故术后谵妄、躁动的发生率较高[2]，而且短时间重复给药还可对神经细胞产生毒性作用，这些不良反应与氯胺酮非特异性拮抗N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体有关[3]。右美托咪定是一种新型α2肾上腺素能受体激动剂，能选择性地与α2肾上腺素能受体结合，具有神经保护作用，但其作用机制尚不清楚。2009年5月～2014年5月，本研究观察了右美托咪定辅助氯胺酮麻醉对大鼠海马区神经细胞凋亡及记忆功能的影响，现分析结果并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 SPF级SD大鼠32只，雌雄不限，8周龄，体质量(237.6±12.1)g，由山东省医学科学院实验动物中心提供。所有大鼠自由摄食、饮水，动物房温度19～22 ℃、相对湿度50%～60%，光照12 h明暗交替。盐酸氯胺酮注射液，广东邦民制药厂有限公司；盐酸右美托咪定注射液，江苏恒瑞医药股份有限公司；5%戊巴比妥钠，上海上药新亚药业有限公司。TUNEL凋亡试剂盒，罗氏诊断产品(上海)有限公司；考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒，北京索莱宝科技有限公司；辣根过氧化物酶、DAB显色试剂盒，北京中彬金桥生物技术有限公司；兔抗大鼠PKC单克隆抗体、兔抗鼠PKC抗体、兔抗大鼠ERK1/2多克隆抗体、小鼠抗大鼠ERK1/2单克隆抗体、小鼠抗大鼠Bcl-2单克隆抗体，美国Sigma公司；RNA提取试剂、SYBR Premix ExTaqⅡ试剂盒，宝生物工程(大连)有限公司；TRIzol试剂、RT-PCR检测试剂盒，美国Invitrogen公司；蛋白酶K、TdT酶，武汉博士德生物工程有限公司。光学显微镜，日本奥林巴斯公司；Morris水迷宫，上海欣软信息科技有限公司；DYY-Ⅲ 2型电泳仪，北京市六一仪器厂；低温超速离心机，美国Sigma公司。

1.2 动物分组处理 所有大鼠适应性喂养1周，按照随机数字表法分为空白对照组、氯胺酮组、右美托咪定组、联合用药组，每组8只。空白对照组腹腔注射生理盐水50 mL/kg，间隔5 min皮下注射生理盐水50 mL/kg；氯胺酮组腹腔注射氯胺酮70 mg/kg，间隔5 min皮下注射生理盐水50 mL/kg；右美托咪定组腹腔注射生理盐水50 mL/kg，间隔5 min皮下注射右美托咪定25 μg/kg；联合用药组腹腔注射氯胺酮70 mg/kg，间隔5 min皮下注射右美托咪定25 μg/kg。每天注射1次，连续注射3天。各组每次麻醉后，仰卧位置于缺氧培养箱中，持续低浓度给氧(2 L/min)。

1.3 相关指标观察

1.3.1 相关生命体征 每组随机取4只，检测以下指标：①呼吸频率：首次注射即刻(t0)及末次注射15、30、45、60、75、90 min(t1～t6)，记录各时点呼吸频率。②翻正反射：每次麻醉后，将大鼠仰卧位固定在固定板上，松开固定后，观察大鼠出现倒下、肌无力、反射消失等时间，若无法自由恢复正常体位，则认定为翻正反射消失。记录末次给药至翻正反射消失以及恢复翻正反射的间隔时间，即翻正反射消失时间、翻正反射消失持续时间。③夹尾反射：用镊子夹持大鼠尾部中下端，每次夹持1～2 s，每5 min操作1次，记录反射完全消失至开始恢复的时间。反射完全消失指连续2次刺激均无反射反应；反射恢复指连续2次刺激均出现反射反应。以夹尾反射消失至重新出现的时间间隔为镇静维持时间。

1.3.2 逃避潜伏期 检测完相关生命体征后进行Morris水迷宫实验。将Morris水迷宫水池分为4个象限，任选一象限在水下放置平台。测试时间设为120 s。测试开始，操作者任选一象限将大鼠面向池壁轻轻放入水中，记录大鼠找到水下平台的时间；找到平台后，在平台上休息1 min，按顺序由下一象限放入水中进行下一次试验。如大鼠120 s内未找到平台，则引导其至平台，并在平台上停留10 s。每天训练4次，训练间隔至少15 min，连续训练5天。最后一次训练结束次日，撤除平台，将大鼠由原先平台象限的对侧放入水中，其找到目标象限的时间即为逃避潜伏期。

1.3.3 海马区神经细胞凋亡率 采用TUNEL法。取各组剩余大鼠，末次注射24 h，腹腔注射戊巴比妥钠3 mL/kg麻醉，完全麻醉后仰卧位固定于动物实验台，手术剪将胸腔剪开，完全暴露心脏，心脏放血同时生理盐水灌注冲洗，待流出液体变为无色后，灌注4%多聚甲醛。待大鼠完全死亡，将头部剪开，取出大脑，完整剥离海马组织，4%多聚甲醛固定24 h。取部分海马组织，常规乙醇梯度洗脱、二甲苯透明，选取双侧海马区平面连续切片。将切片置于载玻片上，10%中性甲醛固定10 min，PBS冲洗3次；依次加入100 μL蛋白酶K溶液静置20 min，100 μL Equilibration Buffer平衡10 min，100 μL TdT酶反应60 min，显微镜下观察。凋亡细胞判断：凋亡细胞核呈棕色染色，细胞明显缩小。随机选取5个400倍视野，计数凋亡细胞数，计算海马区神经细胞凋亡率。海马区神经细胞凋亡率=每视野凋亡细胞总数/每视野细胞总数。实验重复3次，取平均值。

1.3.4 海马区PKC、ERK1/2、Bcl-2蛋白表达 采用Western blotting法。液氮中取出部分海马组织，研磨成粉末，加入蛋白裂解液(0.1%十二烷基硫酸钠，1% NP-40，100 μg/L苯甲基磺酰氟，0.5%去氧胆酸钠，1 mmol/L原钒酸钠，2 μg/mL抑肽酶)，冰浴中充分裂解。收集裂解液，4 ℃、13 000×g离心20 min，BCA法蛋白定量后，-80 ℃保存备用。取150 μg蛋白裂解液，加入等量2×SDS上样缓冲液(100 mmol/L Tris-HCl，4% SDS，20%甘油，0.2%溴酚蓝)，SDS-PAGE分离蛋白，采用半干法将蛋白转印至硝酸纤维素膜上，然后加入TBST室温孵育60 min，再分别加入PKC(1∶100)、PKC(1∶50)、ERK1/2(1∶200)、ERK1/2(1∶100)、Bcl-2一抗(1∶100)，4 ℃孵育过夜；TBST冲洗3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶200)，室温孵育60 min；然后加入ECL化学发光，显影、定影。在iChemi XR imaging system中观察。采用Hema凝胶成像分析系统分析各目的蛋白电泳条带的灰度值。以GAPDH为内参，采用半定量分析法计算目的蛋白相对表达量。目的蛋白相对表达量=目的蛋白电泳条带灰度值/内参蛋白电泳条带灰度值。

2 结果

2.1 各组相关生命体征比较 各组不同时点呼吸频率变化见表1。空白对照组、右美托咪定组翻正反射均未消失，各组维持镇静时间、翻正反射消失时间、翻正反射消失持续时间见表2。各组夹尾反射均未完全消失。

表1 各组不同时点呼吸频率比较±s)

注：与同组t0时比较，*P<0.05；与空白对照组同时点比较，#P<0.05；与氯胺酮组同时点比较，▲P<0.05。

表2 各组镇静维持时间、翻正反射消失时间、翻正反射消失持续时间比较

注：“-”表示未检测到。与氯胺酮组比较，*P<0.05。

2.2 各组逃避潜伏期比较 见表3。

2.3 各组海马区神经细胞凋亡率比较 空白对照组海马区神经细胞凋亡率为(18.38±2.87)%，氯胺酮组为(45.47±7.81)%，右美托咪定组为(17.58±4.70)%，联合用药组为(20.18±4.09)%。氯胺酮组海马区神经细胞凋亡率明显高于空白对照组、右美托咪定组、联合用药组(P均<0.05)，空白对照组、右美托咪定组、联合用药组海马区神经细胞凋亡率比较P均>0.05。

2.4 各组海马区PKC、ERK1/2、Bcl-2蛋白表达比较 见表4。

3 讨论

表3 各组不同时点逃避潜伏期比较±s)

注：与同组第1天比较，*P<0.05；与同组第2天比较，#P<0.05；与同组第3天比较，△P<0.05；与同组第4天比较，▲P<0.05；与空白对照组同时点比较，▽P<0.05；与氯胺酮组同时点比较，▼P<0.05。

表4 各组海马区PKC、ERK1/2、Bcl-2蛋白相对表达量比较±s)

注：与空白对照组比较，#P<0.05；与氯胺酮组比较，*P<0.05。

氯胺酮属于苯环已哌啶类麻醉药，为中枢性NMDA受体抑制剂，可在产生镇痛作用物同时快速诱导分离麻醉，具有镇痛作用强、呼吸抑制作用弱等优点，广泛用于各种浅表手术的麻醉[4]。但氯胺酮属于非特异性拮抗NMDA受体，能够导致躁动、肌肉强直等不良反应，限制了其临床应用。α2受体激动剂具有肌肉松弛作用，能够对抗氯胺酮所致的肌肉强直[5]。有报道称，α2受体激动剂联合氯胺酮可在降低氯胺酮不良反应的基础上，减少各自药物的用量[6，7]。

右美托咪定是一种新型α2肾上腺素能受体激动剂，能选择性地与α2肾上腺素能受体结合，其与α2肾上腺素能受体的亲和力为可乐定的8～10倍。近年研究发现，右美托咪定不仅可辅助用于镇痛和镇静，还具有稳定血流动力学、抑制氯胺酮引起的心血管兴奋作用。右美托咪定辅助氯胺酮麻醉不仅能抑制氯胺酮引起的腺体分泌，降低其对呼吸作用的影响，还可减轻氯胺酮引起的拟交感神经作用，二者联合麻醉已成为一种趋势[8～11]。本研究结果显示，氯胺酮组镇静维持时间显著短于联合用药组，且联合用药组麻醉起效时间明显缩短，麻醉维持时间明显延长，说明右美托咪定联合氯胺酮麻醉能够明显延长镇静时间。本研究还发现，右美托咪定组镇静维持时间明显低于氯胺酮组和联合用药组，提示右美托咪定单药应用镇静效果较差；而联合用药组镇静维持时间明显高于氯胺酮组，提示右美托咪定可增强氯胺酮的麻醉效果。本研究右美托咪定组、联合用药组各时点呼吸频率与基础值比较差异均无统计学意义；氯胺酮组t1、t2、t3时呼吸频率明显高于基础值和右美托咪定组、联合用药组。说明右美托咪定可抑制氯胺酮麻醉时引起的心血管兴奋性，且两药联用呼吸抑制作用轻微，安全性较高。

NMDA受体在中枢神经细胞的发育、增殖、损伤修复中具有重要作用[12]。氯胺酮作为非特异性NMDA受体拮抗剂，可诱导神经细胞凋亡而出现神经毒性作用。然而Sakamoto等[13]研究发现，持续阻断NMDA受体可能会使NMDA受体敏感性升高，当氯胺酮的拮抗作用去除后，神经细胞对谷氨酸等神经毒性物质的敏感性增强，神经细胞内产生大量自由基，继而诱导神经细胞凋亡。有报道称，大鼠氯胺酮麻醉后，其记忆功能可出现不同程度损伤，这可能与神经细胞凋亡有关[14]。乔霖等[15]给予7日龄大鼠腹腔注射25 μg/kg右美托咪定，神经细胞并未见明显凋亡，后期也未发现大鼠学习记忆功能减退。提示右美托咪定可能本身无神经细胞毒性作用。最近国外一项研究发现，α2受体激动剂能够通过抑制谷氨酸盐产生、抑制钙离子内流和降低NMDA受体敏感性发挥神经保护作用[16]。本研究氯胺酮组神经细胞凋亡率明显高于右美托咪定组和联合用药组，说明右美托咪定能够减轻氯胺酮对中枢神经细胞凋亡的影响。Savla等[17]研究发现，右美托咪定能够将细胞内谷氨酸盐主动运输至细胞外，逆转谷氨酸盐的神经细胞毒性作用。本研究还发现，训练第4、5天，氯胺酮组逃避潜伏期明显长于右美托咪定组和联合用药组，与陈欣等[18]报道一致。说明右美托咪定复合氯胺酮麻醉能够改善大鼠的记忆功能。

PKC属于Ca2+依赖性蛋白激酶，与哺乳动物神经细胞的增殖、凋亡密切相关。既往研究证实，氧化应激、谷氨酸盐等均能够诱导PKC活化，并启动相应的信号通路，发挥神经细胞的保护作用[19，20]。ERK1/2是PKC重要的下游信号分子，活化的PKC能够促进ERK1/2发生磷酸化，进而激活转录因子，最终抑制凋亡因子表达而发挥抗凋亡作用。Bcl-2是存在于线粒体外膜上重要的抗凋亡因子。有研究发现，右美托咪定能够破坏Bcl-2/Bax二聚体的平衡，促进Bcl-2表达，从而避免神经细胞发生凋亡[21]。动物实验证实，氯胺酮连续腹腔注射能够抑制海马区PKC-ERK1/2-Bcl-2信号通路，导致海马区神经细胞凋亡[22]。另外，PKC-ERK1/2-Bcl-2信号通路受抑制还可诱导NMDA受体表达增加，使神经细胞更容易受到谷氨酸盐的损伤[23]。本研究结果显示，氯胺酮组海马PKC、ERK1/2、Bcl-2蛋白表达明显低于空白对照组、右美托咪定组和联合用药组，空白对照组、右美托咪定组、联合用药组海马区PKC、ERK1/2、Bcl-2蛋白表达比较差异无统计学意义。提示右美托咪定可能通过激活PKC-ERK1/2-Bcl-2信号通路发挥神经细胞保护作用。

综上所述，右美托咪定辅助氯胺酮麻醉对大鼠海马区神经细胞凋亡具有保护作用，还可改善大鼠的记忆能力，其作用机制可能与激活PKC-ERK1/2-Bcl-2信号通路有关。

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Dexmedetomidine and ketamine combined with anesthesia play an neuroprotective role in hippocampus of rats

JIANGWeirong1,XUYanbing,WANGJingbo

(1TheAffiliatedHospitalofShandongAcademyofMedicalSciences,Jinan250031,China)

Objective To explore the protective effect of ketamine and dexmedetomidine combined with anesthesia on nerve cells in hippocampus of rats. Methods A total of 32 SD rats were randomly divided into the negative control group (NC group), ketamine (K) group, dexmedetomidine (D) group, and K+D group with 8 rats in each group. In the NC group, 50 mL/kg normal saline was injected intraperitoneally, and normal saline was injected subcutaneously after 5 min. In the ketamine group, 70 mg/kg ketamine was injected intraperitoneally, and normal saline was injected subcutaneously after 5 min. In the dexmedetomidine group, 50 mL/kg normal saline was injected intraperitoneally, and 25 μg/kg dexmedetomidine was injected subcutaneously after 5 min. In the K+D group, 70 mg/kg ketamine was injected intraperitoneally, and 25 μg/kg dexmedetomidine was injected subcutaneously after 5 min. The breathing rates, righting reflex time was recorded, the memory function of rats was measured by Morris water maze test at the moment of injection (t0), at the injection of 15, 30, 45, 60, 75, and 90 min (t1-t6). The rats were sacrificed after the administration, neuronal apoptosis in CA region was measured by TUNEL assay, and the expression of PKC, ERK1/2, and Bcl-2 protein was measured by Western blotting. Results Compared with the K+D group, the righting reflex disappeared time of the ketamine group was significantly prolonged, the sedation duration and righting reflex disappeared time was significantly shorter, the difference between the two groups was statistically significant (allP<0.05). The breathing rates of the ketamine group were significantly higher than those of the NC group, dexmedetomidine group, and K+D group at t1, t2, t3(allP<0.05). There was no significant difference between NC group, dexmedetomidine group and K+D group in the escape latency of each period (allP>0.05). On the 4th and 5th days of training, the escape latency of the ketamine group was significantly longer than that of NC group, dexmedetomidine group and K+D group (allP<0.05). The neuronal apoptosis ratio of the ketamine group was significantly higher than that of NC group, dexmedetomidine group and K+D group (allP<0.05). The expression of p-PKC, p-ERK1/2, and Bcl-2 protein of the ketamine group was significantly lower than that of NC group, dexmedetomidine group and K+D group (allP<0.05). Conclusion Dexmedetomidine and ketamine combined with anesthesia have the protective effect on nerve cells in hippocampus of rats by the activation of PKC-ERK1/2-Bcl-2 signaling pathway.

anesthesia; dexmedetomidine; ketamine; apoptosis; memory function; anti-apoptosis signal pathway; rats

山东省医药卫生科技发展计划(2016WSB01061)。

姜卫荣(1972-)，女，主治医师，主要研究方向为临床麻醉。E-mail: jiangweirong72@163.com

10.3969/j.issn.1002- 266X.2017.28.006

R614

A

1002- 266X(2017)28- 0020- 05

2017- 03-10)