IL-36α对银屑病小鼠皮肤病变的影响及其作用机制

朱超英，温炬，李婷，赵琪楠，秦思

(1 南方医科大学附属广东省第二人民医院，广州510317；2南方医科大学第三临床医学院)

IL-36α对银屑病小鼠皮肤病变的影响及其作用机制

朱超英1，2，温炬1，李婷1，赵琪楠1，秦思1

(1 南方医科大学附属广东省第二人民医院，广州510317；2南方医科大学第三临床医学院)

目的 探讨白细胞介素36α(IL-36α)对银屑病小鼠皮肤病变的影响及其作用机制。方法 将30只雌性小鼠随机分为对照组、模型组及观察组，每组10只。模型组及观察组于背部裸露皮肤处涂抹5%咪喹莫特乳膏62.5 mg，对照组涂抹等量凡士林乳膏，1次/d，连续8天。观察组隔日皮下注射IL-36α 5 μg，对照组、模型组注射等量PBS，共注射4次。评估各组建模第1～8天银屑病皮损面积和严重程度评分(PASI评分)。建模第8天处死，测量表皮垂直厚度，分别采用实时荧光定量PCR法、Western blotting法检测皮肤组织血管内皮生长因子(VEGF)和IL-36α mRNA和蛋白相对表达量。结果 随建模时间延长，模型组和观察组PASI评分逐渐升高(P均<0.05)。观察组、模型组建模第5天开始PASI评分明显升高，以观察组升高更明显(P均<0.05)。观察组表皮垂直厚度为(98.519±3.442)μm，模型组为(68.383±2.499)μm，对照组为(9.804±1.682)μm，组间两两比较P均<0.05。观察组、模型组和对照组皮肤组织VEGF、IL-36α mRNA和蛋白相对表达量依次降低，组间两两比较P均<0.05。结论 IL-36α可加重银屑病小鼠皮肤病变，其机制可能与促进VEGF表达有关。

银屑病；白细胞介素36α；血管内皮生长因子

银屑病属于慢性炎症性增生性皮肤病之一，主要组织病理学改变为新生血管形成、角质形成、细胞过度增生及炎症细胞浸润等[1]。白细胞介素36(IL-36)是一种新型促炎性因子，属于IL-1家族，由3个生物学功能相似的分子(IL-36α、IL-36β及IL-36γ)组成。IL-36受体(IL-36R)主要表达于皮肤组织，IL-36与其受体结合后激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和NF-κB，在银屑病、系统性红斑狼疮、干燥综合征等疾病的发生中具有重要作用[2～5]。目前，关于IL-36α在银屑病发病中的作用及其机制尚不完全明了。为此，我们于2016年2～8月进行如下研究。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物：雌性BALB/c小鼠30只，SPF级，6～8周龄，体质量18～20 g，购自南方医科大学。饲养环境：温度20～24 ℃，光照12 h明暗交替，自由摄食饮水。5%咪喹莫特乳膏(美国3M公司)，凡士林乳膏(河北兰炼飞天石化有限公司)，IL-36α(美国R&D公司)，Anti-VEGFA抗体(美国Abcam公司)，ECL显色液及DAB显色液(杭州弗德生物科技有限公司)，逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒(美国DBI公司)；多功能酶标仪(上海现科分光仪器有限公司)，实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)。

1.2 银屑病模型建立及干预 将30只小鼠随机分为对照组、模型组及观察组，每组10只，单笼饲养。各组背部剃毛，裸露皮肤，面积约2 cm×3 cm。模型组及观察组于裸露皮肤处涂抹5%咪喹莫特乳膏62.5 mg，对照组涂抹等量凡士林乳膏，1次/d，连续8天。观察组隔日皮下注射IL-36α 5 μg，对照组、模型组注射等量PBS，共注射4次。

1.3 相关指标观察

1.3.1 银屑病皮损面积和严重程度评分(PASI评分) 观察各组建模第1～8天皮肤变化并行PASI评分。PASI评分标准包括红斑、鳞屑及浸润增厚3个项目，每个项目共4分，无为0分、轻度为1分、中度为2分、重度为3分、极重度为4分，总分12分。PASI评分越高说明银屑病皮损越严重[6]。

1.3.2 皮肤组织病理学变化及表皮厚度 各组于建模第8天采用颈椎脱臼法处死，取背部皮损面积约1 cm×1 cm，4%多聚甲醛固定，脱水，石蜡包埋，3 μm厚切片。常规HE染色，100倍显微镜下观察皮损增厚程度、炎症细胞浸润情况等。同时，测量表皮垂直厚度。

1.3.3 皮肤组织血管内皮生长因子(VEGF)和IL-36α mRNA表达 采用实时荧光定量PCR法。取冻存皮肤组织，TRIzol法提取组织总RNA。根据逆转录试剂盒说明进行逆转录。采用实时荧光定量PCR仪进行扩增。引物序列：VEGF上游引物：5′-GTCTGTGCTCTGGGATTTG-3′，下游引物：5′-ATTTCCACAATCCGAAGTGA-3′；IL-36α上游引物：5′-ACCTCTACATTTGAGTCTGC-3′，下游引物：5′-GATGAAGATTTCCCCCAGTT-3′；GAPDH上游引物：5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，下游引物：5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′。扩增条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s共45个循环。以2-ΔΔCt法计算VEGF和IL-36α mRNA相对表达量。

1.3.4 皮肤组织IL-36α蛋白表达 采用Western blotting法。取冻存皮肤组织，RIPA裂解，提取皮肤组织蛋白，BCA法进行蛋白定量。取适量蛋白样品进行SDS-PAGE，然后将蛋白电泳产物转印至NC膜，用含3%脱脂牛奶的TBST室温封闭1 h。加入一抗(1∶1 000)4 ℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(1∶20 000)室温孵育1 h，ECL显色。采用Image J图像分析系统分析电泳条带的光密度(OD)值。以β-actin为内参，以目的蛋白与内参蛋白OD值的比值作为目的蛋白相对表达量。

1.3.5 皮肤组织VEGF蛋白表达 ①Western blotting法。参照1.3.4的方法检测VEGF蛋白相对表达量。②免疫组化法。皮肤组织石蜡切片经脱蜡、水化，抗原修复，加入一抗(1∶100)4 ℃孵育过夜，加入二抗(1∶1 000)4 ℃孵育50 min。DAB显色，苏木精复染，同步设立阴性对照。以细胞质、细胞核内出现淡棕色、淡褐色、棕色、棕褐色以及褐色颗粒为阳性染色。每张切片随机选取5个高倍镜视野，根据阳性细胞百分比及染色强度综合评分。阳性细胞百分比：0～5%为0分，>5%～25%为1分，>25%～50%为2分，>50%～75%为3分，>75%为4分。染色强度：无着色为0分，淡褐色为1分，棕色为2分，棕褐色为3分。两项评分相加≥1分为阳性。

2 结果

2.1 各组皮肤变化及PASI评分比较 对照组背部皮肤正常，无明显变化。随着建模时间延长，模型组和观察组逐渐出现红斑、增厚、鳞屑；模型组建模第7、8天出现典型银屑病样改变，第8天部分出现脱屑；观察组建模第4～8天开始出现典型银屑病样改变，其红斑、鳞屑、增厚表现均较模型组严重。各组建模第1、2天PASI评分均为0分；随建模时间延长，观察组及模型组PASI评分逐渐升高(P均<0.05)。与对照组比较，观察组、模型组建模第5天开始PASI评分均升高，但观察组升高更明显(P均<0.05)。见表1。

表1 各组建模第3～8天PASI评分比较

注：与对照组同时间比较，*P<0.05；与模型组同时间比较，#P<0.05。

2.2 各组皮肤组织病理学变化及表皮厚度比较 对照组皮肤未见明显异常。模型组呈银屑病样改变，表皮明显增厚，可见鳞屑、角化不全及Muro微脓肿，棘层增厚明显，表皮突延长。观察组各层变化及炎症细胞浸润均较模型组明显。见插页Ⅰ图3。观察组表皮垂直厚度为(98.519±3.442)μm，模型组为(68.383±2.499)μm，对照组为(9.804±1.682)μm，组间两两比较P均<0.05。

2.3 各组皮肤组织VEGF及IL-36α表达比较 观察组、模型组和对照组皮肤组织VEGF、IL-36α mRNA和蛋白相对表达量均依次降低，组间两两比较P均<0.05。见表2。

表2 各组皮肤组织VEGF、IL-36α mRNA和蛋白相对表达量比较

注：与对照组比较，*P<0.05，与模型组比较，#P<0.05。

2.4 各组皮肤组织VEGF蛋白表达比较 见插页Ⅰ图4。免疫组化染色结果显示，对照组VEGF仅少量表达，在真皮乳头微血管轻度染色，呈淡褐色；模型组着色细胞层数及数量显著增多，VEGF显著染色，主要表达于表皮及血管内皮细胞，呈褐色；观察组着色细胞数量多于模型组，VEGF染色呈深褐色，主要表达于表皮层及血管内皮细胞。观察组、模型组和对照组皮肤组织VEGF 阳性表达率分别为100%、100%、10%。观察组、模型组明显高于对照组(P均<0.05)。

3 讨论

多项研究表明，IL-36与银屑病的发生密切相关[7～10]。银屑病发病过程中表皮角质形成细胞加强了VEGF的自我表达，并通过一系列信号传导，促进血管通透性增加及血管内皮细胞增殖、迁移，最终形成新生血管。朱凡等[11]研究表明，由角质形成细胞分泌的VEGF对银屑病皮损部血管异常起着决定性作用。Towne等[2]研究认为，IL-36可促进角质形成细胞分泌VEGF。既往研究表明，IL-17可促进角质形成细胞分泌VEGF，而IL-36又可促进角质形成细胞分泌IL-17[12]，这间接提示IL-36可促进VEGF分泌。有研究发现，IL-1家族中的IL-1及IL-33可促进VEGF分泌[13]，而IL-36也属于IL-1家族，进一步提示IL-36可促进VEGF分泌。

咪喹莫特是一种免疫激活剂，通过激活Toll样受体刺激小鼠产生银屑病样皮损，并已广泛用于银屑病动物模型的建立[14]。本研究结果显示，模型组与观察组在背部涂抹咪喹莫特后逐渐出现红斑、鳞屑、增厚现象，伴有角质层、棘细胞层的增厚以及颗粒层消失，而对照组未见明显异常，表明银屑病小鼠建模成功。既往研究发现，皮下注射IL-36α的小鼠背部皮肤可出现明显的炎症细胞浸润[9]，而气管内灌注IL-36α的小鼠肺部可出现大量的趋化因子、肿瘤坏死因子等炎症因子浸润[15]。本研究结果显示，观察组较模型组皮肤炎症反应更为严重，且观察组、模型组和对照组IL-36α mRNA和蛋白相对表达量依次降低，表明IL-36α可加重银屑病小鼠的皮肤炎症反应。本研究结果显示，与对照组比较，模型组与观察组VEGF mRNA和蛋白相对表达量均明显升高，而观察组升高更明显，表明IL-36α可促进VEGF表达。另外，免疫组化结果显示，对照组表皮层几乎不表达VEGF，仅在真皮乳头层微血管处低表达，呈淡褐色；而模型组与观察组着色细胞层数及数量较对照组增多，VEGF表达于表皮层及真皮层，且观察组着色细胞数量多于模型组，呈深棕褐色；且观察组与模型组VEGF阳性表达率明显高于对照组，进一步证实IL-36α可促进VEGF的表达。

综上所述，IL-36α可加重银屑病小鼠皮肤病变，其机制可能与促进VEGF的表达有关。

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广东省中医药局基金资助项目(20141008)。

温炬(E-mail： gdwenju@163.com)

10.3969/j.issn.1002- 266X.2017.28.010

R758.63

A

1002- 266X(2017)28- 0037- 03

2016- 09- 03)