IL- 18BP阻断由IL- 18诱导大鼠胶原性关节炎对滑膜细胞凋亡表达的影响①

吕 丹 金 迪 王柏山 高玉洁

(辽宁中医药大学附属医院,沈阳110032)

IL- 18BP阻断由IL- 18诱导大鼠胶原性关节炎对滑膜细胞凋亡表达的影响①

吕 丹 金 迪 王柏山 高玉洁

(辽宁中医药大学附属医院,沈阳110032)

目的：探讨IL- 18BP阻断由IL- 18诱导的大鼠胶原性关节炎(Collagen- induced- arthritis，CIA)，对滑膜细胞凋亡表达的影响及可能的作用机制。方法：采用弗氏完全佐剂建立大鼠胶原性关节炎模型，实验共分为5组：正常对照组、CIA模型组、IL- 18- CIA模型组、甲氨喋呤治疗组、IL- 18BP治疗组，每组10只大鼠，共50只。通过免疫组化检测分析各组大鼠左后踝关节的滑膜组织中Fas、FasL的表达水平。结果：IL- 18BP治疗组与模型组比较，大鼠关节肿胀程度得到抑制，Fas、FasL的表达水平显著上调，差异具有统计学意义(P<0.01)；IL- 18BP治疗组与正常对照组比较，无显著性差异(P>0.05)，疗效较好。结论：IL- 18BP可通过调控细胞凋亡基因Fas、FasL的表达，促进滑膜细胞的凋亡，有助于类风湿关节炎的治疗。

类风湿关节炎；IL- 18；IL- 18BP

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是关节滑膜慢性炎症为主的自身免疫性疾病，致残率高。目前普遍认为RA 导致的功能障碍、软骨损害、骨侵袭与滑膜成纤维细胞的凋亡不足密切相关，而细胞凋亡不足是大多数肿瘤和自身免疫性疾病的一个重要病因[1]。研究表明，IL- 18与类风湿关节炎发病过程密切相关，并与病情的活动相关[2]。IL- 18结合蛋白(IL- 18BP)是体内天然存在的 IL- 18 抑制性因子,通过与 IL- 18 竞争性结合抑制其与IL- 18受体结合而抑制其生物活性。本研究通过建立IL- 18诱导的大鼠胶原性关节炎的动物模型，利用IL- 18BP加以阻断，从而分析IL- 18BP对大鼠滑膜细胞凋亡调控基因Fas、FasL表达的影响，探索凋亡与病情之间的相关性，阐明IL- 18BP治疗类风湿关节炎可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 弗氏完全佐剂及牛Ⅱ型胶原(Sigma公司)、CFA(Gibco)辣根过氧化酶标记的羊抗大鼠IgG抗体(华美公司)、重组IL- 18及IL- 18BP(大连宝生物)、甲氨喋呤(上海信通制药厂)、滑膜Fas、FasL检测试剂盒(武汉博士德)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型与分组 Wistar大鼠，近交系，清洁级，8～11周龄，体重150～170 g，共50只，随机分为5组:正常对照组(注射灭菌用水，不加胶原佐剂)、CIA模型组(注射牛Ⅱ型胶原)、IL- 18- CIA组(CIA大鼠皮内注射IL- 18)、甲氨喋呤(MXT)治疗组(IL- 18- CIA大鼠注射甲氨蝶呤)、IL- 18BP拮抗治疗组(IL- 18- CIA大鼠注射IL- 18BP)。每组10只大鼠，造模成功后，于50 d时取各组大鼠的膝及肘以下关节进行组织病理学分析。

1.2.2 滑膜Fas和FasL检测

1.2.2.1 免疫组化制备(采用SP法) 取试验大鼠左后踝关节的滑膜组织及周围组织约1 cm，经Boins液固定7 d后组织脱水。石蜡切片常规脱蜡，用蒸馏水新鲜配制3%H2O2，室温封闭20 min以灭活内源性酶，蒸馏水洗3次。将切片浸入0.01 mol/L枸椽酸缓冲液(pH6.0)，加热至沸腾2 min，冷却后用PBS冲洗，反复2次。滴加正常山羊血清封闭液，室温封闭30 min，甩去多余液体。滴加兔抗人Fas 、FasL抗体(1∶100)，4℃过夜洗脱。加入生物素标记的山羊抗兔IgG，37℃孵育60 min后PBS洗脱，滴加链霉卵白素，室温下30 minPBS洗脱，二氨基联苯胺显色20 min，蒸馏水洗涤，常规脱水，透明，封片。

1.2.2.2 免疫组化结果判定 显微镜观察，对Fas和FasL活性的判定采用4级法评定，1级：色浅、颗粒稀疏；2级：色黄棕、颗粒较细密；3级：棕黄颗粒细密；4级：色棕黑、颗粒密布。将1、2级合为阴性组，3、4级合为阳性组。

1.3 统计学处理 北航医学图像分析管理系统软件分析图片的平均灰度、平均光密度及积分光密度，采用SPSS15.0统计软件包进行t检验分析，P<0.05差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠滑膜中Fas、FasL表达的免疫组化结果 正常对照组大鼠足底无明显红肿,免疫组化结果可见色浅、颗粒稀疏，评级Ⅰ级阴性；CIA模型组大鼠右足跖红肿明显，可见滑膜下组织内大量中性粒细胞及淋巴细胞浸润，滑膜细胞增生，证明造模成功；IL- 18- CIA组滑膜细胞大量增生，炎症浸润明显，组织颜色明显加深，颗粒细密，可达Ⅲ或Ⅳ级判断为阳性结果，证明IL- 18可加重炎症反应及组织损伤；甲氨蝶呤治疗组损伤情况有所好转，但仍可见滑膜细胞增生；IL- 18BP治疗组基本恢复正常，免疫组化结果可见组织颜色变浅，颗粒较细密，可达Ⅱ级。(见图1、2)。

2.2 IL- 18BP对IL- 18干预的CIA模型大鼠滑膜中Fas、FasL表达的影响 IL- 18- CIA组Fas、FasL表达水平显著低于正常对照组和CIA模型组，差异具有统计学意义(P<0.01)， 说明IL- 18可以降低大鼠滑膜中Fas、FasL的表达。

图1 各组大鼠关节滑膜组织Fas免疫组化情况Fig.1 Fas immunohistochemical changes of synovial tissues in all groups Note: A.Normal group；B.CIA model group；C.IL- 18- CIA group；D.MTX group;E.IL- 18BP group.

图2 各组大鼠关节滑膜组织FasL免疫组化情况Fig.2 FasL immunohistochemical changes of synovial tissues in all groupsNote: A.Normal group；B.CIA model group；C.IL- 18- CIA group；D.MTX group；E.IL- 18BP group.

GroupsnFasAOD(x±s)IOD(x±s)FasLAOD(x±s)IOD(x±s)Normalgroup(A)100.36±0.029.7±0.020.32±0.019.0±0.02CIAmodelgroup(B)100.26±0.013)7.83±0.023)0.20±0.023)7.11±0.023)IL-18-CIAgroup(C)100.18±0.054)5.86±0.054)0.08±0.054)4.01±0.054)MTXgroup(D)100.29±0.062)5)8.07±0.042)5)0.26±0.032)5)6.07±0.042)5)IL-18BPgroup(E)100.38±0.021)4)5)6)10.1±0.031)4)5)6)0.38±0.021)4)5)6)10.1±0.031)4)5)6)

Note：Compared with A group,1)P>0.05,2)P<0.05,3)P<0.01;compared with B group,4)P<0.01;compared with C group,5)P<0.01；compared with D group,6)P<0.05.

IL- 18BP治疗组Fas、FasL表达水平较IL- 18- CIA组和CIA模型组显著上调(P<0.01)。与正常对照组比较，IL- 18BP治疗组Fas、FasL水平无明显差异(P>0.05)，而甲氨喋呤(MXT)治疗组和对照组差异明显(P<0.05)，说明IL- 18BP治疗效果优于甲氨喋呤。见表1。

3 讨论

RA滑膜成纤维细胞及淋巴细胞等增生活跃侵蚀软骨基质最终造成关节破坏，研究表明其发病与细胞凋亡过程密切相关[3]。Fas与FasL的相互作用，是引起细胞凋亡的主要途径之一[4]。Fas又称CD95，可以诱导表达Fas的细胞发生凋亡。FasL为Fas的天然配体。Fas/FasL结合可以引起FAS死亡域交联，引起细胞内的Ca2+浓度升高，并且Ca2+的持续流入是Fas介导的DNA降解和细胞凋亡所必需的。Fas/FasL结合还可诱导鞘磷脂酶的活化，使线粒体内死亡基因CED- 3、CED- 4等激活，介导细胞凋亡[5]。RA时无论是滑膜细胞还是浸润的淋巴细胞表达功能性Fas抗原，均可引起细胞凋亡。

本试验发现IL- 18可明显降低CIA及IL- 18CIA大鼠滑膜Fas及FasL的表达，免疫组化图片也显示，IL- 18CIA组大鼠的滑膜细胞大量增生，炎性反应加重。其可能的作用机制是:IL- 18可协同IL- 12诱导IFN- γ生成，从而增强NK细胞的细胞毒作用，促进T细胞增殖，引起炎性反应[6]。另一方面，IL- 18又通过下调滑膜Fas及FasL的表达，抑制关节滑膜细胞等的细胞凋亡，实现免疫逃逸，导致滑膜细胞等过度增生，进一步加重CIA大鼠的病理反应。总之，IL- 18引起细胞凋亡相对不足，而炎性反应过强，可能是IL- 18诱导大鼠胶原性关节炎，加重RA的病理损伤的作用机制之一。

本试验结果显示，IL18- BP可使IL- 18- CIA大鼠滑膜组织中Fas 、FasL表达升高，从而促进IL- 18- CIA大鼠的细胞凋亡，改善类风湿关节炎的关节破坏。证明调节细胞凋亡的调控基因及蛋白是IL- 18BP整体作用的机制之一。李静等[7]认为，通过诱导细胞凋亡以及抑制细胞周期的延长可改善RA关节破坏是目前一种新的治疗方向。由此可见，IL18- BP可作为治疗RA的新方法，是一种凋亡抑制基因药物。

[1] Bartok B,Firestein GS.Fibroblast- like synoviocytes:key effector cells in rheumatoid arthritis[J].Immunol Rev,2010,233(1):233- 255.

[2] 陈良东，林 洁，周剑波，等.类风湿关节炎患者 IL- 17、IL- 18、IL- 6和TNF- α检测的意义[J].当代医学，2010,16(7):13- 14.

[3] 王凤杰，樊莎莎，陈显兵，等.Lunasin 对实验性类风湿关节炎大鼠滑膜成纤维细胞增殖与凋亡的影响[J].免疫学杂志，2016,32(2):114- 118.

[4] 曹永贺，刘 健.类风湿关节炎患者细胞凋亡与临床指标相关性分析[J].中国中西医结合杂志，2016，36(1):35- 39.

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[7] 李 静，叶志中，尹志华，等.类风湿关节炎基因治疗的研究进展[J].风湿病与关节炎，2016,5(11):69- 73.

[收稿2017- 02- 27]

(编辑 倪 鹏)

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《中国免疫学杂志》编辑部

Effects of IL- 18BP blockade on apoptosis of synovial cell in IL- 18- induced mice with Collagen- induced- arthritis

LÜ Dan,JIN Di,WANG Bai- Shan,GAO Yu- Jie.

Affiliated Hospital of Liaoning Traditional Chinese Medical University,Shenyang 110032，China

Objective:To investigate the effects of IL- 18BP blockade on apoptosis of synovial cell in IL- 18 induced Collagen- induced- arthritis(CIA) in mice and its possible mechanism.Methods: CIA mice were established by freund′s complete adjuvant，and divided into 5 groups:normal group,CIA model group,IL- 18- CIA group,MTX group and IL- 18BP group,each for 10,total 50 mice.The expression of Fas and FasL in the synovial tissue of the left posterior ankle joint taken from each group were detected by immunohistochemistry analysis.Results: IL- 18BP group compared with the model group,the mice of joint swelling was inhibited,the expression level of Fas and FasL increased significantly,the difference was statistically significant (P<0.01);IL- 18BP group has a significant curative effect and basically recovered to normal level(P<0.05).Conclusion: IL- 18BP can promote the apoptosis of synoviocytes by regulating the expression of apoptosis genes Fas and FasL,which is helpful for the treatment of rheumatoid arthritis.

Rheumatoid arthritis;IL- 18;IL- 18BP

10.3969/j.issn.1000- 484X.2017.08.008

吕 丹(1984年-)，女，主管技师，主要从事自身免疫性疾病诊断和治疗方面的研究，E- mail:22057830@qq.com。

R392.7

A

1000- 484X(2017)08- 1161- 03

①本文为辽宁省教育厅课题(L2015342)。