甲状腺结节TSH受体基因突变和BRAF V600E突变检测的临床意义

徐伟铭，杨佩浓，袁秋琦

(1.台州恩泽医疗中心(集团)恩泽医院 病理科，浙江 黄岩 318050；2.台州恩泽医疗中心(集团)台州医院 病理科，浙江 台州 317000)

健康科学临床研究

甲状腺结节TSH受体基因突变和BRAF V600E突变检测的临床意义

徐伟铭1，杨佩浓2，袁秋琦1

(1.台州恩泽医疗中心(集团)恩泽医院 病理科，浙江 黄岩 318050；2.台州恩泽医疗中心(集团)台州医院 病理科，浙江 台州 317000)

目的 探讨甲状腺结节TSH受体基因突变和BRAF V600E突变检测的临床意义。方法 收集120例甲状腺结节患者外周血样本，采用PCR扩增TSH受体基因第8号外显子和BRAF V600E基因，并进行测序，统计不同性质甲状腺结节TSH受体基因和BRAF V600E突变率；比较不同临床特征(性别、年龄、肿瘤大小、被膜外侵犯、淋巴结转移、多发病灶、AJCC分期)患者之间突变率的差异，多因素logistic回归模型分析两种突变分别与甲状腺乳头状癌患者临床特征的相关性。结果 120例甲状腺结节组织病理学诊断为恶性的80例，其中53例(66.25%)患者发生TSH受体基因突变，59例(73.75%)患者发生BRAF V600E突变。单因素分析结果显示，甲状腺结节TSH受体基因突变与甲状腺乳头状癌肿瘤大小、淋巴转移、甲状腺被膜外侵犯、多发病灶、AJCC分期等临床病理特征有关(P<0.05)；多因素分析显示淋巴转移、甲状腺被膜外侵犯、多发病灶、AJCC分期均与甲状腺结节TSH受体基因突变有关(P<0.05)。结论 TSH受体基因突变检测和BRAF V600E突变检测有助于判断甲状腺结节良恶性诊断；伴随甲状腺被膜外侵犯，TSH受体基因和BRAF V600E的突变均明显增加。

甲状腺结节；TSH受体基因突变；BRAF V600E突变；检测

甲状腺结节是临床常见的病症，可以单发，也可以多发[1]。大多数甲状腺结节并无明显的临床症状，经高分辨率超声检查的检出率为19%～67%，检出率仍相对低，即便是进行细针穿刺细胞学辅助检查，但仍有10%～40%甲状腺结节不能确定，使得这部分患者治疗缺乏针对性[2]。促甲状腺激素(TSH, thyroid stimulating hormone)受体是甲状腺细胞的一种特异性蛋白质，在生理状态下参与甲状腺滤泡上皮的分泌及生长[3]，TSH受体基因与甲状腺疾病的关系一直备受临床关注。鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1(B-Raf and v-raf murine sacoma viraloncogene homolog B1，BRAF)基因是最重要的原癌基因之一，在BRAF突变中绝大部分突变形式为BRAF V600E突变，据报道，BRAF V600E突变检测有助于甲状腺癌的诊断[4]。本文检测甲状腺结节患者的TSH受体基因和BRAF V600E，观察两者的突变特征及突变率，以期为甲状腺结节的基因检测及靶向治疗提供依据。

1 资料和方法9:10 2017-7-20

1.1 一般资料 选择2013年5月—2016年10月我院收治的甲状腺结节患者140例，男81例，女59例，平均年龄40.7±16.2岁。患者术前经高分辨率超声检查，术后经病理学检查确诊为甲状腺结节。

1.2 基因组DNA抽提方法 治疗前，抽取所有甲状腺结节患者外周血5 mL,采用TakaRa基因组提取试剂盒提取外周血基因组DNA,具体步骤参照试剂盒操作说明。使用NaNodrop 2000c测定基因组DNA的浓度，将所有基因组DNA浓度稀释成统一浓度，同时DNA质量要求A260/A280比值在1.8～2.0之间，A260/A230比值>2。

1.3 TSH受体基因和BRAF V600E突变检测 根据TSH受体基因第8号外显子序列和BRAF V600E基因序列，在Oligo7.5软件上设计其PCR引物，其中TSH受体基因第8号外显子正向引物(TSH-8F): 5’-CCGCTCCATGCCTGTAGCGTAC-3’, TSH-8R:ACTCGCCATAGCTCCACACGTG，扩增片段长度为192bp；BRAF V600E-F：5’-TCATAGTAGTTGCTCTGATAGGAT-3’, BRAF V600E-R：5’-CGCCAATATTAATCAGTGCTA-3’,扩增片段长度为213bp，引物均由上海生工有限公司合成。PCR 20 uL反应体系为：基因组DNA1ul,10X PCR buffer 2 uL，dNTP 2 uL，正反向引物各1 uL，Taq酶0.5 uL，H2O 13.5 uL。反应在PCR仪中进行，扩增程序为：95 ℃预变性3 min, 95 ℃ 30 sec；56 ℃ 30sec；72 ℃ 60s，35个循环，72 ℃延伸3 min。所有PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳证实后，采用胶回收试剂盒回收特异性扩增PCR条带，将回收的条带送往杭州优思达生物技术有限公司进行测序，使用DNAStar软件将测序的序列与理论序列进行比对。统计突变情况。

1.4 干预手段 根据高分辨率超声检查结果分类，140例甲状腺结节患者中20例进一步临床观察，120例患者进行手术治疗，其中行甲状腺全切除术36例，患侧腺叶+峡部切除28例，32例同期行患侧中央区淋巴清扫。

1.5 统计学分析 应用SPSS 18.0统计学软件处理数据；突变率比较采用卡方检验，多因素分析采用logistic回归模型分析；P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 病理学诊断及突变检测 120例甲状腺结节组织病理学诊断为恶性的80例，病理诊断为良性的40例；恶性患者中53例患者发生TSH受体基因突变，突变率为66.25%；59例患者发生BRAF V600E突变，突变率为73.75%。

2.2 不同临床病理特征患者的突变率比较 病理诊断为恶性的80例甲状腺结节患者均为甲状腺乳头状癌，不同肿瘤大小、是否淋巴转移、甲状腺是否被膜外侵犯、是否多发病灶、不同AJCC分期患者的TSH基因突变率间差异显著(均P<0.05)，见表1。

表1 不同临床病理特征患者的TSH基因突变率和BRAF V600E突变率比较

2.3 TSH基因突变和BRAF V600E突变的多因素分析 将单因素分析中具有意义的因素纳入Logistic回归模型行多因素分析，排除交互影响后，结果显示淋巴转移、被膜外侵犯、多发病灶、AJCC分期与甲状腺结节TSH基因突变相关(P<0.05，表2)；甲状腺结节BRAF V600E突变与被膜外侵犯相关(OR=1.433,P=0.004)。

表2 甲状腺结节TSH基因突变多因素分析

3 讨 论

甲状腺结节是内分泌系统的多发病和常见病，甲状腺结节往往是甲状腺疾病首要或唯一的临床表现，其在人群中的发病率为3%～7%[5]。甲状腺结节可有多种病因引起，如增生性结节性甲状腺肿、肿瘤性结节、囊肿、炎症性结节等，不同病因的甲状腺结节治疗方案也不同。

TSH受体蛋白主要分布于甲状腺上皮细胞表面，通过结合TSH，激活CAMP第二信号系统引起一系列生物反应,目前认为，许多甲状腺疾病与TSH受体突变有关，其主要机制是TSH受体突变，使得TSH受体蛋白的结构和免疫源性改变，影响甲状腺细胞的生长及分红，造成甲状腺功能紊乱[6]。本文中80例恶性甲状腺结节患者中，53例患者发生TSH受体基因突变，突变率为66.25%，提示恶性甲状腺结节患者伴发TSH受体基因突变。据报道，血清TSH浓度升高是病发分化型甲状腺癌的独立危险因素，也是影响颈淋巴结转移的因素之一[7]。甲状腺被膜外侵犯、淋巴转移和晚期临床病理分期(Ⅲ、Ⅳ期)是预测甲状腺癌进展、复发、侵袭以及患者死亡的可靠指标[8]，本研究结果显示淋巴结转移、甲状腺被膜外侵犯、多发病灶、AJCC分期与甲状腺结节TSH基因突变相关。提示TSH受体基因突变检测有助于甲状腺癌病情的预测。

本文结果还显示，80例恶性甲状腺结节患者中，59例患者发生BRAF V600E突变，突变率为73.75%，提示恶性甲状腺结节患者伴发BRAF V600E突变[9]。本文中BRAF V600E突变与甲状腺被膜外侵犯相关，与肿瘤大小、淋巴结转移、多发病灶、AJCC分期等无关[10]。

综上所述，TSH受体基因突变检测和BRAF V600E突变检测有助于判断甲状腺结节良恶性诊断；伴随甲状腺被膜外侵犯，TSH受体基因和BRAF V600E的突变均明显增加。

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Clinical value of detection of TSH receptor gene and BRAF V600E mutation in thyroid nodules

XU Wei-ming1， YANG Pei-nong2， YUAN Qiu-qi1

(1.DepartmentofPathology，EnzeHospital，TaizhouMedicalCenter，Huangyan318050;2.DepartmentofPathology，TaizhouHospital，EnzeMedicalCenter，Taizhou317000，China)

Objective To explore the clinical value of TSH receptor gene and BRAF V600E mutation in thyroid nodules. Method Peripheral blood samples of 120patients with thyroid nodules were collected. The eighth-exon of TSH receptor gene and BRAFV600E gene were amplified with PCRand then sequenced. The mutation rate of TSH receptor gene and BRAFV600E in the different thyroid nodules were compared and their correlation with the clinical features of patients with papillary thyroid carcinoma (gender， age， tumor size， capsule invasion， lymph node metastasis， multiple lesions and AJCC staging) were then analyzed. The indexeswith statistical significance analyzed bysingle factor analysis were enrolled into the analysis of multi factor logistic regression model. Findings 80 of120 patients with thyroid nodules were pathologically diagnosed as malignant. TSHgene mutation occurred in 53 cases (66.25%) and BRAFV600E mutation occurred in 59 cases. Single factor analysis showed that the mutation of the TSH receptor gene in thethyroid gland was correlated with the clinical pathological characteristics， including the size of the papillary thyroid carcinoma， lymph node metastasis， thyroid capsule invasion， multiple lesions， and AJCC staging. Multivariate analysis further confirmed that the mutation of the TSH receptor gene in thyroid gland was correlated with the lymph node metastasis， thyroid capsule invasion， multiple lesions， and AJCC staging. Results of single factor analysis and multivariate analysis both showed that the mutation of BRAF V600E in thyroid gland was associated with the invasion of the thyroid gland. Conclusion The detection of TSH receptor gene and BRAF V600E mutation could help to determine the diagnosis of benign and malignant thyroid nodules. With the external invasion of the thyroid gland， the TSH receptor gene and BRAF V600E mutations were significantly increased．

thyroid nodule; TSH receptor gene mutation; BRAF V600E mutation; detection

2016-10-20

徐伟铭(1980-)，男，浙江台州人，本科，主管技师。

10.3969/j.issn.1674-6449.2017.03.010

R736.1

A

1674-6449(2017)03-0271-03