急性心肌梗死大鼠SERCA2a mRNA表达与心肌损伤、心律失常、虚实辨证的相关性分析

范金茹，欧阳过，陈 彤，王建湘，廖建萍，周斐然，谢荣苑



急性心肌梗死大鼠SERCA2a mRNA表达与心肌损伤、心律失常、虚实辨证的相关性分析

范金茹，欧阳过，陈 彤，王建湘，廖建萍，周斐然，谢荣苑

目的 分析急性心肌梗死大鼠肌浆网Ca2+-ATP酶信使RNA(SERCA2a mRNA)表达与心肌组织形态学，心律失常及虚实辨证评分的相关性。方法 将40只SD大鼠分为假手术组、模型组、心痛方组、硫氮卓酮组。采用结扎法制备心肌梗死模型，采用RT-PCR法测定SERCA2a mRNA表达，心肌细胞HE染色观察形态学改变，心电图检测心律失常，虚实辨证评分进行虚实辨证。结果 心肌损伤程度与SERCA2a mRNA表达呈负相关(r=-0.780，P=0.00)；未发生心律失常组SERCA2a mRNA表达明显增多(P<0.00)；SERCA2a mRNA表达与虚实辨证评分呈正相关(r=0.969，P=0.01)。结论 SERCA2a mRNA对心肌组织具有保护作用，SERCA2a mRNA表达与心律失常、虚实辨证具有相关性。

急性心肌梗死；肌浆网Ca2+-ATP酶信使RNA；心律失常；心肌损伤；虚实辨证

最新研究调查显示，心血管病为我国居民的首位死因，其中急性心肌梗死死亡率呈快速上升态势，严重危害人类健康[1]。有研究发现，急性心肌梗死早期心律失常的发生与钙通道调节基因肌浆网Ca2+-ATP酶信使RNA(SERCA2a mRNA)密切相关[2]。心肌梗死属中医“胸痹、心痛”范畴，病机为本虚标实，虚实夹杂[3]。目前尚缺少钙稳态调节与中医虚实辨证相关性研究。本课题对SERCA2a mRNA进行研究，观察对心肌损伤及心律失常的影响，并探讨与中医虚实证型的相关性。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级SD雄性大鼠40只，体重200 g～250 g，鼠龄8周～10周，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK(湘)2011-003。

1.2 主要仪器和试剂 生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司，BL-420F)；动物人工呼吸机(浙江医科大学仪器实验厂，DH-140)；荧光定量PCR仪(厂家ABI，Step One Plus)；台式高速冷冻离心机(Heal Force，Neofuge 15R)；PCR试剂盒、PCR引物(武汉谷歌生物试剂有限公司提供)。

1.3 药品 心痛方中药超微颗粒(湖南中医药大学第一附属医院中药房，批号：681211)组方：柴胡10 g，瓜蒌10 g，桃仁10 g，川芎10 g，白芥子10 g，蒲黄10 g，郁金10 g，九香虫5 g，甘草5 g；硫氮卓酮(湖南中达骛马制药有限责任公司生产，国药准字号：H20065734)。

1.4 实验方法

1.4.1 分组 SPF级雄性SD大鼠40只，按随机表随机分组，分为假手术组(A组)、模型组(B组)、心痛方组(C组)、硫氮卓酮组(D组)4组，每组10只。

1.4.2 造模方法 以结扎冠状动脉前降支建立大鼠急性心肌梗死模型[4-5]。穿线、或结扎后即刻记录心电图，以左室前壁呈发绀或Ⅱ导联S-T段弓背向上抬高大于0.1 mV并持续0.5 h以上，并于结扎点下心肌颜色改变为结扎成功标志(S-T段无改变者淘汰)。假手术组仅开胸，不结扎。

1.4.3 给药方案 手术后给药7 d(前3 d给药同时予青霉素钠肌注抗感染)，均采用灌胃法给药，以60 kg人为标准，参照剂量-体表面积换算方法计算大鼠给药量，药物浓度按大鼠1 mL/100 g灌胃容量配制，心痛方组采用中药超微颗粒冲调成汤剂，浓缩后以1.08 g/kg剂量给药；硫氮卓酮组以2.61 mg/kg剂量药液灌胃；模型组和假手术组均予以等量生理盐水灌胃。每日1次，连续7 d，于第7 d灌胃30 min后处死大鼠。

1.4.4 RT-PCR法测定SERCA2a mRNA表达 取左心室心肌(结扎缺血及坏死区域)约50 mg，将其剪碎，放入1 mL Trizo液中，用1‰ 集碳酸二乙酯(DEPC)液体浸泡的电动匀浆器匀浆，Trizo法提取RNA，参考AMV反转录酶说明书进行反转录。根据基因库基因序列，以Primer5软件进行设计SERCA 2am RNA和β-actin引物：SERCA2a引物，上游5'-AGA TAG CGG GCA TAC TG-3'，下游5'-TCT ATC GCC CGT ATG AC-3'，扩增片段长592 bps；β-actin引物，上游5'-CAC TAT CGG CAA TGA GCG-3'，下游5'-GTG ATA GCC GTT ACT CGC-3'，扩增片段长223 bps。通过凝胶图像分析仪实行吸光度扫描来观察条带的灰度强弱，SERCA2a mRNA吸光度值同GAPDH吸光度的比值表示结果。

1.4.5 HE染色法观察心肌形态学改变 取心室组织浸没于4%多聚甲醛24 h固定，置入梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，经修片，切片成片厚4 μm，HE染色，于光学显微镜下观察心肌形态学[6]。根据心肌形态学改变进行心肌损伤程度评分：心肌纤维排列整齐、无坏死、无炎症细胞浸润记0分；心肌纤维出现凝固性坏死并轻度炎症细胞浸润记1分；大量心肌纤维凝固性坏死并重度炎症细胞浸润记2分。

1.4.6 心电图观察大鼠心律失常 观察大鼠心律失常发生：第1次在造模(或假手术)成功后给药前进行心电图常规记录；第2次给药后第7天，大鼠处死前并根据实际情况随时记录。

1.4.7 大鼠虚实辨证评分 根据中医辨证标准，大鼠一般状况(精神状态、皮肤毛发、鼻尾颜色、呼吸频率、活动量)为观测指标[7]，采取量化分级评分判断虚证实证。根据大鼠精神状态、皮肤毛发、鼻尾颜色、呼吸频率、活动量情况分级打分：精神状态评分(精神萎靡，反应迟钝，眼睑下垂计1分；倦怠乏力，反应欠灵敏计2分；动作缓慢，缺乏生气计3分；活泼好动，反应灵敏计4分)；皮肤及毛发评分(皮肤松弛，皮下无脂肪，抓之触骨，全身毛发枯槁，竖立计1分；皮肤松弛，少许脂肪，易抓取，背部毛发干枯，无光泽计2分；皮肤张力减小，背部毛发少光泽计3分；皮肤与脂肪连接紧密，柔韧有弹性，毛发柔顺有光泽计4分)；鼻、尾颜色(淡红少泽计1分，粉红光淡计2分，红润有光泽计3分、青紫少泽计4分)；呼频率：动物安静时，测每分钟呼吸次数，取3次均值(呼吸频率170次/min～200次/min计1分；呼吸频率130次/min～169次/min计2分，呼吸频率110次/min～129次/min计3分；呼吸频率计70次/min～109次/min计4分)；活动量评分(活动少1分；活动量较少计2分；活动较多计3分；活动多计4分)。大鼠累计得分≤10分辨为虚证，累计得分>10分辨为实证。

2 结 果

2.1 造模结果 40只大鼠，手术中模型组死亡1只，造模后用药前假手术组、硫氮卓酮组、心痛方组各死亡1只，每组纳入实验大鼠为9只。造模用药后假手术组大鼠未出现心律失常及死亡；模型组7只发生心律失常(5例室性早搏，1例室速，1例室颤)，3只大鼠死亡；硫氮卓酮组6只发生心律失常(2例室性早搏，2例房性心律失常，1例传导阻滞，1例室速)，2只大鼠死亡；心痛方组1只发生心律失常(室速)，1只大鼠死亡。由于死亡大鼠均发生心律失常，未纳入统计。

2.2 各组大鼠心肌损伤程度比较 与假手术组比较，模型组及硫氮卓酮组心肌损伤程度评分明显增高(P<0.01)；心痛方组差异无统计学意义(P>0.05)。与模型组比较，心痛方组心肌损伤程度评分明显降低(P<0.01)；与硫氮卓酮组比较，心痛方组差异无统计意义(P>0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠心肌损伤程度比较(±s) 分

2.3 大鼠心肌SERCA2a mRNA表达与心肌细胞形态学改变相关系分析 大鼠SERCA2a mRNA表达量与心肌损伤程度呈负相关(r=-0.780，P=0.00)。

2.4 大鼠心肌SERCA2a mRNA表达与心律失常关系 与心律失常组比较，未发生心律失常组SERCA2a mRNA表达明显增多(P<0.01)，提示大鼠心肌SERCA2a mRNA的表达增高能减少急性心肌梗死大鼠心律失常的发生。详见表2。

组别nSERCA2amRNA心律失常组80.79±0.20未发生心律失常组221.37±0.281) 与心律失常组比较,1)P<0.01。

2.5 急性心肌梗死大鼠心肌SERCA2a mRNA的表达与虚实评分相关性分析 SERCA2a mRNA表达增加，评分越高，SERCA2a mRNA表达与心肌评分损伤程度关系呈正相关(r=0.969，P<0.01)。

3 讨 论

急性心肌梗死具有高死亡率、高致残率特点，这与冠状动脉急性闭塞后心肌损伤和并发心律失常密切相关。有研究发现，心肌Ca2+浓度增加引起心肌损伤，心肌梗死面积显著增大[8]，心肌Ca2+浓度增加可能是急性心肌缺血早期室性心律失常的主要机制[9]。心肌细胞内Ca2+主要储存于肌浆网和线粒体内，静息状态胞浆内游离Ca2+浓度低，缺血缺氧造成心肌细胞损伤后胞浆内Ca2+浓度明显升高[10]。SERCA2a是一种P型离子激活型ATP酶，通过消耗三磷酸腺苷(adenosine triphos-phate，ATP)将胞浆中多余的Ca2+泵入肌浆网中，以维持心肌细胞内外巨大的浓度差，因此SERCA2a可调控心肌胞浆浓度和维持心肌细胞钙稳态[11]。已有研究表明，SERCA2a表达增多通过增加肌浆网的Ca2+再摄取以改善心力衰竭[12-13]。

本实验研究发现，SERCA2a mRNA表达增强时，心肌损伤程度降低，提示SERCA2a mRNA表达对急性缺血缺氧后心肌具有明显保护作用。未发生心律失常组SERCA2a mRNA表达明显升高，提示增加SERCA2aRNA活性可减少心律失常发生。SERCA2aRNA减轻心肌损伤，减少心律失常发生的机制尚未明确，可能与SERCA2a将心肌胞浆多余的Ca2+泵到肌浆网，减少Ca2+超载有关。

冠心病属中医“胸痹、心痛”范畴，急性期主要表现邪盛标实，后发展多为虚证或虚实夹杂[14]。急性心肌梗死则类似中医“真心痛”，属胸痹严重病证，发生时以痰瘀互结，寒凝气滞表现为主，常因实致虚，甚者亡阴亡阳，阴阳离决。本研究发现，心肌梗死后实证组大鼠SERCA2a mRNA表达明显高于虚证组大鼠，两者关系呈正相关。推测其原因可能与心肌能量物质ATP含量相关。冠状动脉闭塞后，心肌供血急剧减少，而SERCA2a依赖能量将胞浆中的Ca2+摄入肌浆网中。故ATP增多时，SERCA2a mRNA活性增强，中医症状学多表现为实证；ATP产生减少时，SERCA2a mRNA活性减弱，中医症状学多表现为虚证。

心痛方以“心痛治肝，肝心同治”，“急则治其标，治实以防虚变”为特色，根据疏肝化瘀豁痰法立方，为主治痰瘀互结气郁证胸痹心痛的有效验方，其临床疗效确切，前期动物实验从炎症反应通路证实心痛方能缩小大鼠心肌梗死面积，抑制血小板-白细胞相互反应，对心肌有保护作用[15-16]。本实验显示，心痛方能显著增加SERCA2a mRNA表达，明显降低心肌损伤，减少心律失常的发生，对心肌组织具有保护作用，提示其保护机制可能与增加SERCA2a活性密切相关。SERCA2a活性与虚实辨证密切相关，但机制尚未明确需进一步研究。

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(本文编辑薛妮)

Correlation of SERCA2a mRNA with Myocardial Injury,Arrhythmia,Syndrome Differentiation of Deficiency and Excess in Rats with Acute Myocardial Infarction

Fan Jinru，Ouyang Guo，Chen Tong， Wang Jianxiang， Liao Jianping， Zhou Feiran，Xie Rongyuan

The First Hospital，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410007，Hunan，China

Objective To investigate the correlation of sarco-endoplasmic reticulum calcium ATPase 2a (SERCA2a) mRNA with myocardial injury，arrhythmia，syndrome differentiation of deficiency and excess in rats with acute myocardial infarction (AMI).Methods Forty Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into sham operation group，model group，Xintongfang group and Diltiazem control group.The myocardial infarction model was established by using ligation method.Expression of SERCA2a mRNA was detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) method.The arrhythmia was tested by electrocardiogram. The morphological changes were observed by Hematoxylin-Eosin (HE) staining. The syndrome differentiation of deficiency and excess was made by scoring criteria. Results The degree of myocardial injury was negatively correlated with SERCA2a mRNA expression(r=-0.780，P=0.00).Expression of SERCA2a mRNA in non- arrhythmia group was significantly increased (P<0.01) . The expression of SERCA2a mRNA was positively correlated with syndrome differentiation score (r=0.969，P=0.01).Conclusion SERCA2a mRNA has protective effect on myocardial tissue，and SERCA2a mRNA expression is associated with arrhythmia and syndrome differentiation of deficiency and excess.

acute myocardial infarction；sarco-endoplasmic reticulum calcium ATPase 2a mRNA；arrhythmia；myocardialinjang；syndrome differentiation of deficiency and excess

湖南省教育厅科学研究项目(No.16A159)

湖南中医药大学第一附属医院(长沙 410007)，E-mail：fanjr218@sina.com

信息：范金茹，欧阳过，陈彤，等.急性心肌梗死大鼠SERCA2a mRNA表达与心肌损伤、心律失常、虚实辨证的相关性分析[J].中西医结合心脑血管病杂志，2017，15(14)：1716-1718.

R542.2 R256.2

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.14.010

1672-1349(2017)14-1716-03

2017-02-28)