联合使用固力康和特立帕肽对去卵巢大鼠股骨干骺端骨量、骨强度的影响

谢辉

湖北省荆门市第一人民医院创伤手足外科，湖北 荆门 448000

骨量严格受骨形成和骨吸收的平衡调控，当两者之间的平衡被打破时就会出现一系列的疾病包括骨质疏松。骨质疏松表现为骨吸收相对增强，渐渐出现骨量减少、骨脆性增加，容易在低能量创伤下出现骨折，这也是这类疾病的主要危害[1]。目前抗骨质疏松药物主要通过促进骨吸收和/或抑制骨吸收来防治骨质疏松，如甲状旁腺激素(1-34,PTH)，双膦酸盐类，然而对于严重的骨质疏松， PTH和双膦酸盐类联合使用对患者的骨密度提高并没有叠加作用，可能是双膦酸盐类降低骨转换和限制了骨重建的进程[2]。组织蛋白酶K是在破骨细胞中高表达的半胱氨酸蛋白酶，对I型胶原的降解起着重要的作用[3]。早期的研究表明组织蛋白酶K抑制剂(KKI)，它选择性抑制骨吸收，对骨形成影响很小[4,5]。综上所述，我们假设，组织蛋白酶K抑制剂和PTH联合使用可能有助于增加骨量，骨强度。

本研究通过联合使用KKI和PTH来治疗去卵巢大鼠，观察其对大鼠股骨干骺端的疗效，为临床上两者药物联合的使用提供实验基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物

12 周龄SPF级SD 雌性大鼠50只，体重225～250 g，由上海斯莱克动物公司提供许可证号:(SCXK(沪)2007-0005，合格证号:2007- 000548429)。所有动物在温度为(24.0±0.5) ℃，湿度为45%～50%， 通风良好的环境下饲养，每周称体重 1 次。每次手术后前3天所以大鼠给予青霉素肌肉注射(2.5万U/kg)预防感染。

1.2材料

固力康(日本卫材株式会社)；PTH(GIBCO 公司)；Micro-CT (SkyScan1176，荷兰),显微镜(ZEISS Axio Imager M1，德国)，Image-Pro Plus全自动图像分析仪(Media Cybernetics，美国)，生物力学实验机(MTS-858，美国)。

1.3 骨质疏松动物模型的建立及治疗

50只大鼠随机分成2组即OVX组(n=45)切除双侧卵巢以建立骨质疏松动物模型和Sham组不切除双侧卵巢建立假手术模型。手术开始前，所有大鼠称重，根据体重，适量腹腔注射10% 水合氯醛(3 mL/kg)进行麻醉，麻醉成功后，于大鼠背部正中线中下 1/3处作一长约 2 cm 纵行切口，向两侧钝性分离皮下软组织，于脊柱旁开0.5 cm处钝性分开肌肉组织，显露卵巢脂肪包被组织，轻轻提起卵巢，于输卵管卵巢交界处丝线结扎，完整摘除双侧卵巢，逐层缝合，关闭创口。正常环境下饲养12 w后各组取5只大鼠处死股骨行骨密度测量仪检测来检验骨质疏松建立模型建立情况。随后所有的去卵巢(OVX)大鼠随机的分成4组：OVX组、KKI组、PTH组、PTH+KKI组。KKI组、PTH组、PTH+KKI组大鼠术后给予固力康6 mg/(kg·d)灌胃，特立帕肽60 μg/kg皮下注射，每周3次、固力康6 mg/(kg·d)灌胃加特立帕肽60 μg/kg皮下注射，每周3次直至去卵巢术后12 w。随后所有大鼠处死取股骨行Micro-CT、骨生物力学、HE组织切片检测。

1.4 Micro-CT检测

所有存活的大鼠在术后12 w时处死，完整取下大鼠双侧股骨，剔除周围软组织， 生理盐水冲洗后，采用10%多聚甲醛固定用于Micro-CT 检测。扫描条件为：图像矩阵为2048 ×2048， 整合时间为 200 ms，能量/强度为70 kVp、 114 μA、 8 W。以 0°旋转， 进行扫描。扫描完成后， 选取生长板远端1.0 mm、 层厚2.0 mm的骨组织为松质骨感兴趣区域(region of interest，ROI)进行三维重组， 最低阈值为 160 提取图像信息。获得大鼠股骨感兴趣区域骨微结构参数骨体积分数 (bone volume/total volume，BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁数量(trabeculae number，Tb.N)、 骨小梁分离度(trabecular spacing，Tb.Sp)、连接密度(connective density，Conn.D.)及骨密度(BMD)。

1.5 HE组织切片

待所有股骨经过Micro-CT检测后，所有标本用4%多聚甲醛固定，梯度酒精脱水，甲基丙烯酸甲酯包埋。包埋块修整后置于硬组织切片机沿胫骨纵轴冠状面切片，清洗打磨抛光，切片最终厚度约为30～40 μm，切片在荧光显微镜及光镜下观察。然后将标本放置在EDTA 脱钙液中浸泡，每3～4 d换液1 次，连续脱钙4 w，X 线检测是否脱钙完全，然后充分水洗，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，HE染色，Olympus BX5l多功能显微镜下观察股骨干骺端骨生长情况，骨小梁的微观结构及分布。

1.6 生物力学测定

取右侧股骨，将其置于MTS-858型生物力学实验机上，支点跨距17 mm，中点为加压点，加载速度为 2 mm/min，计算机记录载荷-位移曲线，根据曲线计算最大载荷和刚度。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 手术对大鼠的影响

至实验截止时间，有2只大鼠由于手术不当、麻醉不当和伤口感染死亡，它们都属于OVX组，最终共有38只大鼠进入最终试验结果评估。术后12 w时两组大鼠股骨的骨密度变化由骨密度测量仪检测所得，Sham组大鼠的股骨骨密度为241.21±31.78 (mg/cm2)，而OVX组大鼠股骨骨密度为171.24±28.31 (mg/cm2)。相对Sham组，OVX组大鼠的骨密度下降40.93%(P<0.05)，结果表明骨质疏松模型建立是成功的。

2.2 股骨骨密度的改变

药物治疗12 w时，大鼠股骨干骺端通过Micro-CT扫描后通过内置软件所得的各组股骨骨密度如表1所示；相对于OVX组，KKI、PTH、PTH+KKI各组股骨骨密度分别增加了19.09%、28.62%、39.26%，有明显的统计学意义(P<0.05)。从结果可以发现相对于单独使用PTH和KKI，联合使用两者对去卵巢大鼠股骨骨密度提高更明显。

注：与OVX组比较，*P<0.05;与SIM组比较，#P<0.05;与PTH组比较，&P<0.05

2.3 Micro- CT 三维重建分析及骨微观参数

通过Micro- CT对感兴趣区域进行三维重建，重建的结果如图1所示，通过内置软件计算的骨微观参数如表1所示。通过观察图1可以明显发现：相对OVX组而言，KKI、PTH、PTH+KKI各组的骨小梁数量明显增多，而且骨小梁联系紧密，骨小梁更粗。骨微观参数更加明确的表明PTH+KKI组有最高的BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Conn.D和最低Tb.Sp，而OVX组有最高的Tb.Sp和最低BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Conn.D。和OVX组比较，KKI、PTH、PTH+KKI各组骨微观参数有明显的统计学意义(P<0.05)，从结果可以发现相对于单独使用PTH和KKI，联合使用两者对去卵巢大鼠股骨骨量提高更明显。

图1 药物治疗12 w时各组大鼠股骨干骺端Micro-CT三维重建结果Fig.1 3D reconstruction of micro-CT images in the metaphysis of the left femurs of the rats in each group after 12-week treatment

图2 药物治疗12 w时各组大鼠股骨干骺端HE组织切片结果Fig.2 The results of HE staining of the histological slices in the metaphysis of the left femurs of the rats in each group after 12-week treatment

2.4 HE组织切片结果

大鼠左侧股骨切片经过HE染色结果如图2所示，结果表明KKI、PTH、PTH+KKI各组干骺端的骨量远远大于OVX组，且骨小梁之间联系紧密，排列有规律；而OVX组骨小梁稀疏，且骨小梁纤细，部分骨小梁出现断裂，这表明KKI和PTH明显增加股骨干骺端骨量，HE切片的观察结果进一步证实Micro-CT的结果。

2.5 骨生物力学结果

股骨三点弯曲试验中，KKI、PTH、PTH+KKI组最大载荷、刚度均高于OVX组PTH+KKI组有着最大的载荷、刚度值，且各组之间比较有明显的统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 药物治疗12 w时各组大鼠股骨(右)三点弯曲试验的结果Table 2 The 3-point bending test results of the right femurs of the rats in each group after 12-week treatment

注：与OVX组比较，*P<0.05;与SIM组比较，#P<0.05;与PTH组比较，&:P<0.05

3 讨论

本次实验中使用雌性SD大鼠经过去卵巢12 w来建立骨质疏松模型，经过全身使用PTH及KKI来改变去卵巢大鼠的骨代谢，药物治疗12 w后处死大鼠取下双侧股骨行Micro-CT、HE切片及骨生物力学检测，实验的结果表明相对于单独使用PTH及KKI，联合使用两者可以明显增加股骨BMD，提高股骨干骺端微观参数，保护骨小梁的质和量，增加股骨最大载荷及刚度；这暗示联合使用PTH及KKI对骨质疏松的治疗有叠加作用。

骨质疏松症是一种以骨量降低，骨组织显微结构发生退变，导致骨脆性增加，骨强度下降，易导致骨折的骨骼疾病[6]。随着世界老年化进展，骨质疏松的患病率越来越高，骨质疏松相关骨折已经成为很大的世界性难题，防治骨质疏松对临床医生来说是一项巨大的挑战[7]。虽然双膦酸盐类、地诺单抗、雌激素在治疗骨质疏松都有不错的疗效，但是常常会出现一些不利因素影响其临床应用，如双膦酸盐类人体吸收率低，不适用于有血栓栓塞性疾病或肾功能不全者[8]；地诺单抗使用时出现下颌骨坏死率[9]；雌激素会加大妇科肿瘤的发病率。其严重后果是发生骨折及骨折后难以愈合， 严重影响患者的生活质量。为了取得最大疗效， 人们寻求联合治疗或序贯治疗的方法防治骨质疏松症。间歇性小剂量使用PTH具有促进骨合成代谢作用，并可改善骨微结构，增加骨量。本研究表明间歇性小剂量使用PTH确实具有提高骨质疏松状态下骨密度，增加骨量。

本实验中使用KKI是一种四烯甲萘醌合成物，它可以有效抑制组织蛋白酶K形成，促进骨形成作用，同时抑制破骨形成，可以有效提高血清骨钙素浓度[10]。我们发现联合使用PTH和KKI可以明显的增加股骨骨量及骨强度，这说明它们同时使用有互相促进作用。具体的机制尚不清楚，这可能和两者的促进骨形成的机制有关。PTH具有强烈的促进成骨作用和破骨细胞有偶联系性，而KKI抑制破骨细胞的作用并不影响PTH成骨作用，这与PTH和双膦酸盐类联合使用不同，双膦酸盐类抑制破骨细胞的活性的同时也会影响到PTH的成骨效果；而KKI抑制骨吸收且不影响到破骨细胞的数目，增加骨形成[11,12]，因此并不会影响PTH的作用，这种结果导致两者联合使用有叠加作用。

本次试验也有其局限性，首先实验大鼠数量有限，且时间较短，12w之后动物骨质疏松的具体情况不知。我们没有进一步进行机制探索，但是这次试验从体外很好的证实 PTH 联合 KKI可以协同防治骨质疏松，为其在临床药物方面提供了可能性。但目前动物实验中用于治疗骨质疏松药物的效果较好，但是在人体这个复杂环境，且联合使用PTH 和KKI治疗骨质疏松会进一步增加治疗成本，临床上具体实施仍需进一步研究。