葛根素抑制吡格列酮诱导的成骨细胞凋亡

卢宇 费小蔷 杨淑芳 徐邦奎 马咏梅 赵成媛 李湘怡

泰州市人民医院内分泌科，江苏 泰州 225300

过氧化物酶体增殖物激活受体γ (peroxisome proliferators activated receptor，PPARγ)激动剂是一类在临床中广泛应用的口服降糖药物，其代表性药物有吡格列酮和罗格列酮。临床使用中发现PPARγ激动剂的副作用之一是增加女性特别是绝经后女性的骨质疏松和骨折风险[1]。既往研究表明PPARγ激动剂可以增加成骨细胞的凋亡，抑制成骨细胞的增殖[2]。Duan等[3]的研究发现，20 μmol/L吡格列酮作用于MC3T3-E1细胞24 h，可以明显抑制成骨细胞的增殖活性，促进细胞凋亡。在17β-雌二醇缺乏的情况下，TZDs可以诱导成骨细胞凋亡，上调骨硬化蛋白的表达，从而导致骨质的流失[4]。在雌激素缺乏的去卵巢雌性大鼠模型中过表达PPARγ会导致骨密度减少，但在雄性大鼠中过表达PPARγ对骨密度没有影响[5]。提示雌激素缺乏与PPARγ激动剂导致的骨质疏松有关，雌激素或许可以改善PPARγ激动剂导致的骨质疏松。

雌激素替代疗法可以使绝经后女性骨质疏松的风险降低50%，降低冠心病的发生率，改善绝经后女性生活质量[6]，但是长期服用雌激素会使子宫内膜癌和乳腺癌等疾病的风险明显增加[7]。近年来来源于自然的植物性雌激素越来越受到推崇。葛根素是一种植物性雌激素，具有抗骨质疏松的作用，且具有调节血压、血糖、血脂，抗炎，抑制血小板聚集，抗氧化，抑制肿瘤等作用[8, 9]。

本实验拟通过观察葛根素对吡格列酮诱导的成骨细胞凋亡的影响及凋亡相关蛋白的表达，探讨葛根素调节骨代谢的功能及分子机制。

1 材料和方法

1.1 材料

小鼠成骨细胞株MC3T3-E1(小鼠颅顶前骨细胞亚克隆14)购自中国科学院细胞库。葛根素由南京正大天晴制药有限公司提供，吡格列酮由江苏德源药业有限公司提供。MTT 试剂盒由碧云天生物技术研究所提供。Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒由江苏凯基生物技术股份有限公司提供。Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-8抗体由Cell Signaling Technology提供。Bcl-2、Bax抗体由Santa Cruz Biotechnology提供。羊抗兔二抗由武汉谷歌生物科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1细胞培养及实验分组：MC3T3-E1细胞用a-MEM培养基 (含10%胎牛血清，1%青霉素及链霉素溶液)，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。当细胞进入对数生长期时进行药物干预。

1.2.2MTT检测细胞活性：分组：正常对照组(Control)、0.01-100 μmol/L的葛根素组(PUE)、20 μmol/L吡格列酮组(PIO)、0.01-100 μmol/L的葛根素+吡格列酮组(PUE+PIO)，干预24 h。取对数生长期的MC3T3-E1 细胞，按2×103个/孔接种于96 孔培养板。细胞融合达80%时根据实验分组进行干预，干预24 h后加入MTT(5 mg/mL)继续孵育4 h，吸去上清，每孔加入100 μL DMSO振荡10 min 使结晶充分溶解，检测490 nm波长处OD值。

1.2.3流式细胞术检测细胞凋亡：分组：正常对照组、1 μmol/L，葛根素组、吡格列酮组(20 μmol/L)、1 μmol/L葛根素+吡格列酮组。采用 Annexin V-FITC 细胞凋亡试剂盒检测检测细胞凋亡率。取对数生长期胞按1×105/孔接种 12 孔板，干预 24h后用不含 EDTA 的胰酶消化收集，冷PBS洗涤细胞两次，加入500 μL Bingding Buffer重悬细胞，加入5 μL Annexin V-FITC 混匀，室温避光反应 10 min，再加入5μL PI混匀，室温避光应 15 min，1 h内流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.4Western blot 检测各组凋亡相关蛋白的表达：上述细胞加入裂解液提取蛋白，冰浴30 min，4 ℃ 14 000 rpm 离心15 min，取上清，纯化的蛋白用BCA 法进行蛋白浓度测定。取20 g μ蛋白样品在聚丙烯酰胺凝胶上行SDS-PAGE，电泳结束后转印至PVDF 膜上。5%脱脂奶粉封闭非特异性抗体，加入稀释一抗4 ℃孵育过夜。次日用TBST洗膜3 次，加入二抗室温孵育1h，洗膜，ECL 法成像。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 不同浓度葛根素和吡格列酮对成骨细胞增殖的影响

各组药物干预成骨细胞24 h后，与对照组相比，吡格列酮组的细胞增殖活性明显下降(P<0.05 )，0.1、1、10 μmol/L葛根素组细胞增殖活性明显增强(P<0.05 )。而与吡格列酮组相比，吡格列酮+0.1及1 μmol/L葛根素组的细胞增殖活性明显增强(P<0.05)，其中吡格列酮+1 μmol/L葛根素组有最大的促细胞增殖作用，后续试验均选用1 μmol/L葛根素进行，见图1。

图1 不同浓度葛根素和吡格列酮对成骨细胞增殖的影响(24 h)(*P<0.05，与对照组比较；# P<0.05，与吡格列酮组比较)Fig.1 Different concentrations of puerarin and pioglitazone on osteoblasts proliferation (24h)(*P<0.05 compared with control group； #P<0.05 compared with pioglitazone group)

2.2 葛根素和吡格列酮对成骨细胞凋亡的影响

与对照组相比，干预成骨细胞24 h后，吡格列酮组细胞凋亡率明显升高(P<0.05)，1 μmol/L葛根素组的细胞凋亡率似乎有下降的趋势，但无统计学差异(P>0.05)。而与吡格列酮组相比，吡格列酮+1 μmol/L葛根素组的细胞凋亡率明显下降(P<0.05)，见图2。

图2 葛根素和吡格列酮对成骨细胞凋亡的影响(24 h)A: 流式细胞术检测成骨细胞凋亡；B:各组细胞的凋亡率(*P<0.05，与对照组比较；# P<0.05，与吡格列酮组比较)Fig.2 Puerarin and pioglitazone on osteoblasts apoptosis (24 h)A: Flow cytometry detection of osteoblasts apoptosis; B: Apoptosis rate of different groups(*P<0.05 compared with control group； #P<0.05 compared with pioglitazone group)

2.3 葛根素和吡格列酮对成骨细胞凋亡相关蛋白表达的影响

与对照组相比，吡格列酮组活化的caspase-3和caspase-8的表达明显上升，加入葛根素以后，活化的caspase-3表达下调，而活化的caspase-8表达无明显变化。与对照组相比，吡格列酮组Bax的表达上升，Bcl-2的表达下降。加入葛根素以后，Bax的表达无明显变化，Bcl-2的表达上调，Bax/ Bcl-2下调，见图3。

图3 Western blot法检测各组成骨细胞凋亡相关蛋白的表达Fig.3 Western blot detection of osteoblasts apoptosis related protein expression of different groups

3 讨论

PPARγ激动剂是一种广泛使用的口服降糖药，参与调节脂肪细胞和成骨细胞的分化、脂质代谢和周围组织的胰岛素敏感性[10]。它可以增强外周组织(脂肪组织、骨骼肌)和肝脏对胰岛素的敏感性，减轻胰岛素抵抗，促进葡萄糖的摄取和利用，调节脂肪酸代谢，从而能有效地控制血糖[11]。但随着使用时间的延长，临床研究发现PPARγ激动剂会增加骨质疏松和骨折的风险。一项临床研究表明[12]吡格列酮会促使绝经后妇女的骨密度降低，骨量减少。大型临床研究ADOPT研究[13]报道，在罗格列酮组中，女性的骨折发生率为9.3%，明显高于二甲双胍组和格列本脲组中女性的骨折发生率(5.1%；3.5%)。Soroceanu等[14]用PPARγ激动剂喂养 C57BL/6 小鼠 90 天后发现，成骨细胞/骨细胞数量和活性下降，抗凋亡因子Bcl-2 表达降低。一项研究发现，PPARγ激动剂曲格列酮可以导致成骨细胞MC3T3-E1凋亡，主要是由于曲格列酮可以通过上调 p38 信号通路，激活caspase-3 而诱导成骨细胞凋亡[15]。Yasuda 等[16]研究发现环格列酮、吡格列酮在成骨细胞显著地增强了FGF-2 诱导的SAP/JNK 的磷酸化，促凋亡因子Bax表达增加。本研究的结果也表明吡格列酮可以激活caspase-3、caspase-8，上调促凋亡因子Bax，下调抗凋亡因子Bcl-2，促进成骨细胞的凋亡。

葛根素是一种植物性雌激素，多项动物体内实验研究结果表明葛根素具有抗骨质疏松作用。Wang等[17]的研究表明，葛根素可以促进大鼠成骨细胞的增殖和分化，并且可以通过激活雌激素受体依赖的 MEK/ERK和 PI3K/Akt信号通路而抑制顺铂诱导的成骨细胞凋亡。另一项研究[18]则发现低浓度葛根素(0.001-10 μmol/L)可以促进成骨细胞增殖，增加ALP活性，而高浓度葛根素(100-1 000 μmol/L)则会抑制成骨细胞增殖，减少ALP活性。Liu等[19]研究表明，葛根素可以通过ERK通路抑制成骨细胞凋亡，上调Bcl-2的表达，下调Bax的表达。Yu等[20]研究发现葛根素可以增加成骨细胞的增殖活性，通过抑制JNK信号通路、激活PI3K/Akt信号通路而抑制地塞米松诱导的成骨细胞凋亡。本研究的结果表明葛根素可以促进成骨细胞增殖，并且可以抑制吡格列酮诱导的成骨细胞凋亡。该作用可能是通过上调抗凋亡因子Bcl-2、下调caspase-3蛋白的表达而实现的。

Caspase-3处于细胞凋亡的下游，是caspase级联“瀑布”下游最关键的凋亡执行蛋白酶，在各种因素启动的凋亡程序中起最后的枢纽作用，可在人体正常组织和多种肿瘤组织中广泛表达[21, 22]。细胞凋亡有两条经典的凋亡途径，一条是细胞外途径(细胞表面死亡受体途径)，该途径又称为caspase-8依赖途径；另一条是细胞内途径(线粒体引发途径)。细胞表面死亡受体途径是研究最多的凋亡途径，通过Fas、TNFRl、DR3等死亡配体与死亡受体结合，募集pro-caspase-8，形成死亡诱导信号复合物(DISC)，随之caspase-8被激活，传导凋亡信号，活化caspase-3。但有研究发现大多数中药抗癌药物可通过诱导线粒体释放细胞色素c至胞浆中，导致产生Apaf-l和pro-caspase-9激活，形成全酶复合物凋亡体(apoptosome)，进而激活caspase-3，使细胞凋亡。YU等[20]的研究发现吡格列酮可以通过线粒体途径抑制成骨细胞凋亡。本研究结果显示葛根素可以降低吡格列酮导致的成骨细胞caspase-3表达升高，但是不能降低吡格列酮导致的成骨细胞caspase-8表达升高，提示葛根素发挥抗凋亡作用不是通过细胞外途径，可能是通过其他途径来完成的。

众所周知Bcl-2 蛋白是细胞凋亡抑制因子，它自身发生同源二聚化或与Bax形成同源的蛋白二聚体，这是细胞凋亡的启动子[23]。这两种蛋白是细胞凋亡的关键介质，他们表达的比率受凋亡诱导因子调控。在本研究中我们发现葛根素可以通过上调吡格列酮导致的Bcl-2 表达水平的下降、降低Bax/ Bcl-2 比例来抑制成骨细胞的凋亡。

总的来说，本实验证明葛根素可以抑制吡格列酮导致的成骨细胞凋亡，为葛根素进一步应用于临床治疗糖尿病骨质疏松提供理论基础，但具体抗凋亡的机制还需进一步研究。