葛根素联合国产多孔钽对人成骨细胞COL-I、OC、OPN表达和细胞增殖的影响

刘永庆 李琪佳 甘洪全 王茜 张大鹏 王志强*

1.华北理工大学，河北 唐山 063000 2.华北理工大学医学中心实验室，河北 唐山 063000 3.华北理工大学附属医院骨科，河北 唐山 063000 4.华北理工大学基础医学院，河北 唐山 63000

葛根素是从中药葛根中提取的主要药用成分，属于植物雌激素[1]。近年研究发现，葛根素能剂量依赖性促进大鼠原代成骨细胞分化，对老年骨质疏松症和骨折愈合具有良好的治疗作用[2]。葛根素可能通过雌激素受体介导促进成骨细胞增殖及骨形成作用，当葛根素在1×10-10mol/L至1×10-7mol/L浓度范围内时，其对成骨细胞促增殖作用最强[3]。多孔钽材料呈三维连通多孔网状结构，表面均匀分布的蜂窝状孔隙，内部包含大量微孔结构，可增加细胞对纤维素的捕获能力并且能够促进成骨细胞黏附与聚集，加快骨整合及整合强度，促进骨长入，加快骨形成[4]。本研究试图探讨植物类雌激素葛根素和国产多孔钽材料对成骨细胞增殖和分化的作用机制以及为临床应用植物雌激素和国产多孔钽支架材料治疗骨愈合和再生提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

MG-63人成骨细胞株购自北京协和医学院细胞库；国产多孔钽支架材料由重庆润泽医疗器械有限公司提供；葛根素购置陕西安康制药；JSM-6030LV扫描电子显微镜购置日本电子株式会；CCK-8法细胞增殖检测试剂盒购置北京天恩泽基因有限公司；RT-PCR试剂盒购置美国Invitrigen公司；兔抗人COL-I抗体、兔抗人OC抗体、小鼠抗人OPN抗体和兔抗人GAPDH均购置于美国ABGENT公司。

1.2 方法

1.2.1MG-63人成骨细胞的培养：MG-63人成骨细胞用含10% FBS、1% NEAA、1%双抗的α-MEM完全培养基培养，并置于37℃、5% CO2培养箱中，约2～3d即可铺满瓶底，细胞生长汇合至80%时可进行传代。

1.2.2扫描电镜观察：利用扫描电镜观察多孔钽支架材料表面结构、孔隙形态；观察培养第5天的多孔钽-成骨细胞和葛根素多孔钽-成骨细胞复合培养的多孔钽支架材料表面形态。

1.2.3药物处理细胞：取对数生长期的MG-63细胞，培养24 h待细胞贴壁后，更换含有1% FBS的α-MEM培养基培养24 h，使细胞同步化。然后加入不同终浓度的葛根素(0.01、0.1、1 μmol/L)，各浓度组设置3个复孔。

1.2.4成骨细胞与葛根素和多孔钽支架材料共培养：国产多孔钽支架材料先用超声波清洗器清洗15 min，高压蒸汽灭菌30 min。放入无菌6孔板，α-MEM培养液预湿，24 h后弃去多余液体，备用。取300 μL密度为2×104个/mL的不同终浓度的葛根素(0.01、0.1、1μmol/L)药物处理细胞悬液，接种在多孔粗支架材料表面，置于37℃，5% CO2的培养箱内培养2 h，将多孔钽材料上下翻转，并按上述接种方法滴加材料另一面，并置于37℃，5% CO2的培养箱内培养2 h，各孔加入2 mL的α-MEM培养液，继续培养。

1.2.5实验分组：葛根素组：不同终浓度葛根素(0.01 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L)与MG-63人成骨细胞共培养。并筛选出葛根素作用最佳剂量浓度组，行进一步实验；多孔钽组：国产多孔钽支架与MG-63人成骨细胞共培养；葛根素多孔钽组：葛根素、国产多孔钽与MG-63人成骨细胞共培养；空白组：单纯MG-63人成骨细胞培养。

1.2.6CCK-8法检测各组对成骨细胞增殖的影响：取生长状态良好的MG-63细胞，制成单细胞悬液，6组均以每孔2×104个/mL的细胞密度接种于无菌24孔板中，将其置于37℃、5% CO2培养箱中培养，每隔48h更换1次培养基；连续培养至7d，每隔2天每组各取12孔，每孔均更换500μL新的培养基，并加入50 μL CCK-8溶液，将24孔板置于37℃、5% CO2培养箱中继续培养2 h；在24孔板各孔中吸取100 μL上清并依次加至96孔板各孔中；在波长490 nm处用酶标仪检测96孔板各孔吸光度(OD值)。

1.2.7RT-PCR法检测各组细胞COL-Ⅰ、OC、OPN mRNA的表达水平：按照Trizol一步法提取培养5d的各组成骨细胞总RNA。并根据公式计算出总RNA浓度和纯度，RNA浓度统调整为500 ng/μL，利用M-MuLV逆转录酶合成cDNA，利用Primer5.0软件设计引物，合成的各基因PCR引物序列(如表1)。利用SYBR qPCR Mix 进行PCR扩增体系反应，设定反5 s，56℃退火25 s，72℃延伸20 s，总共40个循环，72℃延伸5 min。通过相对定量方法Comparative Delta-delta Ct 分析PCR结果。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primers sequences

1.2.8免疫细胞化学染色法检测各组细胞COL-I、OC、OPN蛋白的表达情况：将各组制成单细胞悬液，以1×106个/mL密度接种于预先置有无菌盖玻片的6孔板中。待细胞生长至半汇合后，取出无菌盖玻片，PBS洗盖玻片3次，4%多聚甲醛固定30 min，弃去多聚甲醛溶液，PBS洗3次；滴加适量0.5% Triton-100至盖玻片上，室温条件下裂解20 min，PBS洗3次，2 min/次；滴加适量3% H2O2至盖玻片上，室温孵育15 min，达到阻断内源性过氧化物酶的作用，PBS洗3次；滴加各适量一抗(1∶150)；4℃过夜，PBS洗3次，2 min/次；滴加适量二抗，37℃培养箱中孵育30 min，PBS洗3次，每次2 min；进行DAB显色，将盖玻片浸入梯度酒精内进行逐级脱水，二甲苯透明，中性树胶进行常规封片，采用Image Pro-Plus图像分析软件半定量分析染色指数结果。

1.3 统计学分析

运用SPSS17.0统计软件对实验数据进行统计处理。统计分析采用单因素方差分析，进行各组间两两比较时，采用LSD-t检验方法，进行两个实验因素的各水平组合的实验时，采用两因素析因设计资料的方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 扫描电镜下观察多孔粗支架材料及复合物

国产多孔钽大体观察呈蜂窝状，光洁，质硬，表面粗糙不平，分布均匀的空隙，针尖样大小(图1A)。扫描电镜观察，国产多孔钽支架材料具有大量均匀分散的微孔结构，直径约400～600 μm，内部孔隙之间相互连通，孔隙间小梁支柱呈微孔样结构(图1B)。扫描电镜下观察成骨细胞在多孔钽表面和微孔内成叠层黏附生长，伸出细胞伪足，细胞间相互连接并融合成片状，分泌的基质覆盖于多孔钽支架表面及微孔内(图1C、D)。表明人成骨细胞在国产多孔钽支架上伸展性良好，可连接成片状，细胞基质分泌正常，细胞及细胞基质可覆盖多孔钽表面。

2.2 各组成骨细胞增殖情况

通过酶标仪测得各组OD值(见表2)。随着培养时间的延长，葛根素组细胞增殖活性显著高于空白组，但葛根素不同浓度组(0.01 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L)，以葛根素1 μmol/L组细胞的生长最快，差异统计学意义(P<0.05)；多孔钽组细胞增殖活性亦显著高于空白组(P<0.05)；葛根素组和多孔钽组细胞增殖活性无统计学差异(P>0.05)。经析因方差分析得出，葛根素和多孔钽均可促进成骨细胞的增殖活性，两者之间具有协同促进细胞快速增殖的作用。

表2 CCK-8法检测各组细胞生长增殖情况(OD)Table 2 CCK-8 to detect the osteoblasts proliferation in different groups of cells (OD)

注：△：P<0.05VS其它各组；*：P<0.05VS空白组；※：P<0.05VS空白组

2.3 各组成骨细胞COL-Ⅰ、OC和OPN mRNA的表达水平

本实验通过比较CT法对数据进行分析处理，各组成骨细胞COL-Ⅰ、OC和OPN mRNA的相对表达量结果(见表3)。葛根素组和多孔钽组的COL-Ⅰ与OC mRNA表达量均显著高于空白组(P<0.05)，葛根素组和多孔钽组的COL-Ⅰ与OC mRNA表达量无显著性差异(P>0.05)，葛根素多孔钽组COL-Ⅰ与OC mRNA表达量均显著高于其它各组，各组间OPN mRNA的表达差异无统计学意义(P>0.05)，各组间经析因方差分析得出：葛根素和多孔钽均可促进成骨细胞COL-Ⅰ与OC mRNA的表达，两者之间具有协同促进COL-Ⅰ与OC mRNA的表达作用，但对OPN mRNA的表达无显著影响。

组别COL-ⅠOCOPN葛根素组1.48±0.58∗1.50±0.13∗1.10±0.12多孔钽组1.44±0.61※1.52±0.22※1.08±0.28葛根素多孔钽组1.92±0.25△1.87±0.63△1.13±0.56空白组1.001.001.00F23.60720.4632.401P0.0030.0010.125

注：△：P<0.05VS其它各组；*：P<0.05VS空白组；※：P<0.05VS空白组

2.4 各组成骨细胞COL-I、OC、OPN蛋白的表达情况

采用Image-Pro Plus图像分析系统对各组进行半定量分析得出结果(见图2、3、4和表4)。COL-I、OC和OPN蛋白均表达于成骨细胞胞浆，阳性反应呈棕黄色颗粒，可见各组细胞均不同程度表达COL-Ⅰ、OC与OPN，细胞胞浆中可见大量棕黄色颗粒。葛根素组和多孔钽组的COL-Ⅰ与OC表达量均显著高于空白组(P<0.05)，葛根素多孔钽组COL-Ⅰ与OC表达量均显著高于其它各组(P<0.05)，葛根素组和多孔钽组的COL-Ⅰ与OC表达量无显著性差异(P>0.05)，但各组间OPN蛋白的表达量无统计学意义(P>0.05)。经析因方差分析得出：葛根素和多孔钽均可促进成骨细胞COL-Ⅰ与OC蛋白的表达，两者之间具有协同促进COL-Ⅰ与OC蛋白表达的作用，但对OPN蛋白的表达无显著影响。

组别COL-IOCOPN葛根素组16.690±0.890∗17.643±1.328∗16.243±0.625多孔钽组16.943±0.944※17.575±1.043※16.345±1.452葛根素多孔钽组18.170±0.629△19.043±1.328△16.382±0.328空白组14.170±0.53816.243±1.12815.896±0.628F17.68218.2582.674P0.0000.0000.064

注：△：P<0.05VS其它各组；*：P<0.05VS空白组；※：P<0.05VS空白组

图2 免疫细胞化学染色观察各组COL-I蛋白表达情况(×200)注：A：葛根素组；B：多孔钽组；C：葛根素多孔钽组；D：空白组Fig.2 The expression of COL-I protein of each group observed by immunocytochemical staining (×200)

图3 免疫细胞化学染色观察各组OC蛋白表达情况(×200)注：A：葛根素组；B：多孔钽组；C：葛根素多孔钽组；D：空白组Fig.3 The expression of OC protein of each group observed by immunocytochemical staining (×200)

图4 免疫细胞化学染色观察各组OPN蛋白表达情况(×200)注：A：葛根素组；B：多孔钽组；C：葛根素多孔钽组；D：空白组Fig.4 The expression of OPN protein of each group observed by immunocytochemical staining (×200)

3 讨论

钽素有“亲生物”金属之称，具有良好的生物相容性、较高的孔隙率和与人松质骨相近的弹性模量与强耐酸性等优势[5,6]。许多学者将其称为骨小梁金属[7]。多孔钽骨植入物现已广泛应用于关节置换、股骨头坏死、骨缺损等骨科领域。本研究采用的国产多孔钽支架材料呈三维连通多孔网状结构，扫描电镜观察多孔钽表面呈蜂窝状孔隙，内部包含大量微孔结构，直径约400～600 μm，内部空隙相互连通。此材料是由重庆润泽医疗器械有限公司和国内多家高校科研机构共同研制的国产多孔钽。国产多孔钽材料表面粗糙，增加了成骨细胞与支架材料的接触面积，增加细胞对纤维素的捕获能力并且能够促进成骨细胞黏附与聚集，加快骨整合及整合强度，利于细胞黏附生长，可促进骨长入，加快骨形成[8]。

葛根素一种异黄酮类化合物，具有减慢心率、扩张血管、降血压的作用，临床主要用于治疗高血压、心绞痛、脑供血不足和脑梗死[9,10]。因其对骨质疏松有预防作用，近几年引起研究者的广泛关注。有研究通过体外培养人成骨细胞，发现葛根素能促进成骨细胞的增殖、分化，提高碱性磷酸酶活性，对碱性磷酸酶活性也有较好的刺激作用，这可能提示葛根素具有提高成骨细胞骨形成的功能[11]。因此，本研究进一步探索葛根素和国产多孔钽材料对成骨细胞影响的研究。扫描电镜观察表明葛根素对人成骨细胞在国产多孔钽支架上伸展性良好，可连接成片状，细胞基质分泌正常，细胞及细胞基质可覆盖多孔钽表面，具有良好的生物学相容性。CCK-8法检测不同浓度葛根素和国产多孔钽支架对人成骨细胞增殖的影响。实验结果表明不同浓度的葛根素均促进成骨细胞的快速增殖，但以葛根素1 μmol/L组细胞增殖最快，差异有统计学意义(P<0.05)。国产多孔钽亦可促进成骨细胞的快速增殖，但葛根素多孔钽组相对其他各组成骨细胞的快速增殖更加显著(P<0.05)，经多重比较分析，两者之间具有协同促进成骨细胞增殖的作用。本课题组前期研究也显示国产多孔钽具有良好的三维立体空间构型及良好的生物相容性，可促进成骨细胞粘附和生长[12]。林凤飞等[13]也研究发现多孔钽金属对成骨细胞生长无不良影响，且适应成骨细胞粘附、生长及分化，具有良好的生物相容性。臧洪敏等[13]研究发现不同剂量的葛根素均可促进成骨细胞的增殖和分化及矿化的作用，以中高剂量作用最明显，与本研究结果相一致。

Ⅰ型胶原(Type I collgaen，COL-I)、骨钙素(osteocalcin，OC)和骨桥蛋白(osteopontin，OPN)是重要的成骨相关因子，是成骨细胞分化的标志物。COL-I由成骨细胞分泌的特异性胶原蛋白，是主要的骨结构蛋白，为钙盐沉积和细胞黏附提供支架，可作为评价成骨细胞功能状态的指标；OC是由成骨细胞特异性分泌的一种非胶原蛋白，是成骨细胞向基质矿化的标志物，可反映成骨细胞活性；OPN也是成骨细胞的标志物之一，OPN促进骨基质的吸收、矿化，在参与骨形成与骨改建过程中发挥重要作用。

本研究采用RT-PCR法和免疫细胞化学染色法检测成骨细胞成骨相关因子COL-I、OC、OPN mRNA和蛋白的表达，成骨细胞COL-I、OC、OPN蛋白均表达于胞浆，阳性反应呈棕黄色颗粒。结果发现葛根素组和多孔钽组相较对照组均可促进成骨细胞COL-I、OC mRNA和蛋白的表达，差异具有统计学意义(P<0.05)，葛根素组和多孔钽组之间COL-I、OC mRNA和蛋白表达无显著差异(P>0.05)，葛根素多孔钽组细胞COL-I、OC mRNA和蛋白的表达均显著高于其它各组(P<0.05)，各组成骨细胞OPN mRNA和蛋白的表达无明显差异(P>0.05)。经析因方差分析得出，葛根素和多孔钽支架两者具有协同促进成骨细胞COL-I、OC表达的作用，对OPN的表达无显著影响。本课题组前期研究利用免疫细胞化学和Western blot法检测国产多孔钽复合MG-63细胞培养Col-I、OC和OPN蛋白表达，结果提示多孔钽复合培养组出现Col-I、OC表达的增强，OPN的表达无明显差异。国产多孔钽材料可能通过影响Col-I、OC的表达，有利于MG-63细胞的黏附、生长，具备良好的生物相容性[15,16]。耿丽鑫等[12]采用RT-PCR检测结果显示国产多孔钽促进成骨细胞成骨基因OPN、OC及FN mRNA的表达升高。袁斯远等[17]等研究发现葛根素和雌二醇可增加BSP、OC mRNA的表达。葛根素和雌二醇能够减少OPN mRNA的表达，表明葛根素能够通过影响成骨细胞分化相关特征性蛋白mRNA表达，促进成骨细胞的分化。赵艳威等[18]研究发现葛根素在0.01-1μmol/L剂量内，以剂量依赖性方式显著提高ALP活性和COL-I的分泌促进人成骨细胞分化成熟，

综上所述，本研究初步探索葛根素和国产多孔钽对人成骨细胞成骨相关因子COL-I、OC、OPN表达和细胞增殖的影响，为葛根素和国产多孔钽支架材料治疗骨缺损、骨折愈合提供了科学的理论依据，并且扩展了葛根素的药用价值和临床试用范围，在固有临床治疗骨质疏松的基础上，扩展了新的思路与方法。并且提高了我国中药材葛根的使用范围，推动了其药用价值和经济价值。同时在研究的过程中，也是对中药材分子生物学实验的一种积极尝试和探索。也是对中西医结合治疗骨修复的一次积极的探索和尝试。葛根素可作为骨移植支架材料修复骨缺损的辅助药物，并具有促成骨的作用，为进一步临床应用提供理论和实践依据。