补肾、健脾、活血法对去卵巢致骨质疏松症大鼠骨骼、骨骼肌IкBα含量影响的对比研究

金成日 姜奥 杨芳

1.辽宁中医药大学附属第四医院，辽宁 沈阳 110100 2.沈阳市第五人民医院，辽宁 沈阳 110023 3.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是以骨组织显微结构受损，骨矿成分和骨基质等比例不断减少，骨质变薄，骨小梁数量减少，骨脆性增加和骨折危险度升高的一种全身骨代谢障碍的疾病，是中老年人群最常见的骨骼疾病。2001年美国国立卫生研究院(NIH)提出的“骨质疏松症”的定义为，以骨强度下降、骨折风险增加为特征的骨骼系统疾病。随着我国人口老龄化日趋明显，骨质疏松症必将成为老龄化社会需面对的公共健康问题。

目前，针对骨质疏松症的中医研究多是基于“肾藏精主骨”理论论述其病因病机，而从“脾主四肢肌肉”探讨其病因病机的较少。本实验研究采用分子生物学实验方法，以骨质疏松症大鼠的骨骼、骨骼肌IкBα为检测指标，观察骨骼肌收缩与骨骼协调性对骨质疏松症形成的影响，同时探讨中医不同治法对骨质疏松症的防治效果和作用机制的异同。

1 材料和方法

1.1 主要仪器设备

Infinite M200多功能酶标仪、MR1822低温高速离心机。

1.2 主要试剂

IкBα试剂盒(AMEKO 公司)内含：96 微孔板、一抗液、样品稀释液、酶标抗体液、底物稀释液、洗涤液。

1.3 实验动物

选用清洁级Wistar大鼠60 只，雌性且未曾交配，体重(200±50)g，4～5月龄。由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物质量合格证号：1100170659。

术前将大鼠按照随机分组的方法分为正常组(8只)、手术组(52只)。采用摘除大鼠双侧卵巢的方法致骨质疏松症模型。术后7d 将手术组存活的大鼠随机分为4组(每组8只)，即：模型组、补肾方组、健脾方组和活血方组。

1.4 药品

补肾组选用左归丸，制备方法: 按大鼠每千克体重一日药量计算，熟地2.52 g、山药1.26 g、枸杞子1.26 g、山茱萸1.26 g、川牛膝1.26 g、菟丝子1.26 g、鹿角胶(河南老君堂制药有限公司，国药准字241020792) 1.26 g，龟板胶(河南老君堂制药有限公司，国药准字241020792) 1.26g 打碎、烊化，混合上述颗粒剂，加20 mL水。健脾组选用补中益气颗粒(北京汉典制药有限公司)。活血组选用身痛逐瘀汤 (辽宁中医药大学药厂)。

1.5 实验方法

1.5.1造模：用10%水合氯醛将通过肌肉注射麻醉大鼠，麻醉后的大鼠采用俯卧位姿势固定于自制的手术台上，从腰背部脊柱两侧作纵行切口切开皮肤及肌肉，摘除两侧卵巢组织后逐层缝合，关闭创口。正常组不手术。

1.5.2给药：术后第7 d 开始给药，每日上午灌胃1 次，连续灌胃12 w。补肾组、健脾组和活血组的大鼠，每日用药量按成人用药量的6.3 倍计算，大鼠胃容量为0.875 mL/100 g。正常组和模型组以等量生理盐水注射灌胃。灌胃期间，每周一对大鼠称重1次，按照体重调整给药剂量。

1.5.3取材：第12 周大鼠灌胃结束，禁食24 h 后取材。用10%水合氯醛将大鼠肌肉注射麻醉后取材。无菌条件下取大鼠右后肢腓肠肌的白肌部分和左后肢的全股骨，放入高压灭菌的EP 管内，做好标记后放入-70 ℃冰箱保存备用。

1.6 检测指标及方法

用ELISA 方法检测实验大鼠骨骼、骨骼肌IкBα含量，用酶联仪在450 nm 波长依序测量各孔的吸光度(OD值)，绘制标准曲线，计算样品的实际浓度。具体操作方法按试剂盒说明书进行。

1.7 统计学处理

2 结果

与正常组比较，模型组大鼠离体股骨上1/3骨密度极显著降低(P<0.01)；与模型组比较，各治疗组大鼠股骨上1/3骨密度均有不同程度的升高(P<0.01)，其中以补肾中药组升高最为显著(表1)。

与正常组比较，模型组大鼠骨骼的IкBα含量显著降低(P<0.01)；与模型组比较，补肾组、健脾组、活血组大鼠骨骼的IкBα含量明显升高(P<0.01)，其中补肾组升高程度比较明显，其次为健脾组(表2)。

与正常组比较，模型组大鼠骨骼肌的IкBα含量显著降低(P<0.01)；与模型组比较，补肾组、健脾组、活血组大鼠骨骼肌的IкBα含量均有升高，但与模型组比较无统计学意义(表3)。

组别n骨组织正常组80.177±0.007模型组80.132±0.018∗补肾组80.165±0.006∗▲健脾组80.153±0.003∗▲活血组80.157±0.005∗▲

注：与正常组比较,*P<0.01；与模空组比较,▲P<0.01

组别 n骨组织正常组87.090±0.09模型组83.102±0.27∗补肾组84.585±0.18∗▲健脾组84.350±0.34∗▲活血组83.515±0.13∗▲

注：与正常组比较，*P<0.01；与模型组比较，▲P<0.01

组别 n骨骼肌正常组87.078±0.18模型组84.325±0.55∗补肾组84.325±0.26∗健脾组84.591±0.44∗活血组84.257±0.16∗

注：与正常组比较，*P<0.01；与模空组比较，▲P<0.01

3 讨论

3.1 “脾肾相关”与骨骼、肌肉的关系

中医学认为肾为先天之本，“肾在体合骨”，指骨的生长发育，有赖于骨髓的充盈及其所提供的营养，肾精充足，骨髓生化有源，骨骼得到髓的滋养，才能坚固有力。若肾精不足，骨髓生化乏源，骨骼失去营养，而骨质脆弱无力。清代医家唐容川在《医经精义》中说到：“肾藏精，精生髓，髓生骨，故骨者，肾之所合也；髓者，肾精所生，精足则髓足；髓在骨内，髓足者则骨强”。人到了中老年时期，肾中精气开始逐渐亏虚，骨髓化源不足，骨骼失去滋养而骨质脆弱疏松，容易出现骨质脆弱、腰膝酸软、易于骨折等症状，因此中老年人群易发原发性骨质疏松症。女性至七七后，任脉虚、太冲脉衰少、天癸竭，肾精不足而不能维持骨骼的正常功能，因此绝经后的女性也易发骨质疏松症。因此，肾虚是骨质疏松症发病的根本原因，补肾方法是临床治疗该病的根本方法。

中医学认为脾为后天之本，主四肢肌肉，为气血生化之源。脾对骨骼的生长也具有一定的作用，若脾失健运，四肢肌肉得不到充分的营养，同时肾失所藏，后天之精又不得以补充，肾精不足，筋骨失养，则骨痿不用。在《素问·生气通天论》中提到：“是故谨和五味，骨正筋柔，气血以流，腠理以密，如是则骨气以精，谨道如法，长有天命。”《灵枢·本神》也提到：“脾气虚则四肢不用”。“金元四大家”之李东垣在《脾胃论》中亦提到“大抵脾胃虚弱，阳气不能生长，是春夏之令不行，五脏之气不生。脾胃则下流乘肾，……则骨乏无力，是为骨痿。令人骨髓空虚，足不能履地，是阴气重叠，此阴盛阳虚之症。”可见，“脾肾相关”而肌肉和骨骼的关系十分密切。

3.2 IкBα含量的变化对骨质疏松症影响

核因子Kappa B(NF-κB)是一种能与免疫球蛋白κ 轻链基因增强子κB序列特异结合并调节κ轻链转录的核蛋白因子。NF-κB 可以参与细胞生长、分化及炎症反应等基因表达调控，在很多常见的情况下出现NF-κB 的异常激活或抑制，如肿瘤、糖尿病、动脉粥样硬化等[1-3]。NF-κB 在基因的调节表达的功能是多方面的，NF-κB 二聚体与其NF-κB 抑制因子(IκB) 家族的成员结合，以无活性的三聚体形式存在于胞浆中。经典的IκB 家族成员有IκBα、IκBβ、IκBε。IκBα主要通过经典旁路途径调节Rel/p50 异源二聚体。

成骨细胞增殖分化的抑制或成骨细胞凋亡进程的加速，能使骨形成少于骨吸收从而导致OP的发生，而NF-κB 信号通路在成骨细胞的增殖分化和凋亡过程中都有着重要的作用。研究[4]表明导致骨质疏松症NF-κB 异常活化的途径有：①正常情况下，雌激素与雌激素受体结合能抑制NF-κB 的表达，在去卵巢所致的OP 模型中，由于缺乏足够的雌激素与雌激素受体结合导致NF-κB 的异常活化[5]；②OP时，T细胞和其他细胞高度表达炎症细胞因子，能促进成骨细胞中NF-κB 活化，活化的NF-κB 同时能促进TNF-α、IL-6、IL-1 的转录，使其表达增加，NF-κB 与炎症细胞因子形成一个循环放大的过程[6]。大量NF-κB 的活化，使骨形成受抑制，导致OP 发生。

3.3 中医不同治法对骨质疏松症大鼠骨骼、骨骼肌IкBα含量影响的比较研究

从本实验结果来看，与模型组比较，经中医不同治法治疗的骨质疏松症大鼠骨骼的IкBα含量明显升高，其中补肾组升高程度比较明显，其次为健脾组；说明补肾和健脾方法，通过提高骨骼的IкBα含量可以抑制NF-κB 异常活化，减缓成骨细胞的凋亡过程，使骨形成多于骨吸收，有效的防治骨质疏松症。经中医不同治法治疗的骨质疏松症大鼠骨骼肌的IкBα含量虽然与与模型组比较无统计学意义，但可以看到补肾组和健脾组有升高的趋势，说明补肾和健脾方法，通过提高骨骼肌的IкBα含量可以抑制NF-κB 表达，从而提高肌肉的能量。

从上述结果来看，补肾和健脾方法，通过提高骨骼、骨骼肌的IкBα含量，提高骨骼和肌肉的协调性，从而有效的防治骨质疏松症，说明提示补肾方法是临床治疗骨质疏松症的根本方法。健脾方法是辅助补肾方法治疗骨质疏松症的一个重要治法。