双膦酸盐类药物的生物学应用研究进展

高欢 尹东锋

双膦酸盐类药物被认为是治疗与骨相关疾病的一线药物，但其最早是用于纺织和石油工业的防腐剂和络合剂[1]。上世纪六十年代，Fleisch 等[2]发现了它们的药理活性，骨矿物质的主要成分是羟基磷灰石[Ca10（PO4）6（OH）2，HA]，通过与羟基磷灰石结合抑制其溶解来防止钙化，因此发现了双膦酸盐类药物在骨骼疾病中的潜力。随着研究的不断深入，各种亲和力高、毒副作用小、治疗作用强的新型双膦酸盐类药物接连问世，成为Paget 病、骨质疏松症、恶性肿瘤骨转移相关的高钙血症的一线治疗药物[3]，为大多数骨疾病患者所服用，尤其是绝经后患有骨质疏松症的妇女。但双膦酸盐类药物的口服生物利用率低，因此有文献提出了几种递药系统来改善其生物利用度的问题[4]。

1 双膦酸盐的结构特征及作用机制

双膦酸盐（Bisphosphonates，BPs）是上世纪70年代发展起来的抗代谢性骨病的一种新药，治疗Paget 病、骨质疏松症、骨转移、恶性肿瘤相关的高钙血症和小儿骨病[5]。BPs 是焦磷酸盐的不可水解类似物，焦磷酸盐和双膦酸盐之间的结构差异是氧原子连接的两个磷酸根被一个碳原子取代，即双磷酸盐中的P-C-P 基团取代了焦磷酸盐的P-O-P基团，是双膦酸盐特有的结构，两个基团R1和R2连接到双膦酸盐的中心碳原子上，如果R1为羟基（-OH），则双膦酸盐对羟基磷灰石的亲和力可以增加，如阿仑膦酸盐[6]。双膦酸盐中的氧原子可以与HA 中的钙离子螯合，而表现出对骨的强亲和力（见图1）。

图1 焦磷酸盐（A）和双膦酸盐（B）的基本结构式

目前，临床上所使用的BPs 根据其上市时间和结构特点分为三代（见表1）。第一代双膦酸盐药物，如依替膦酸盐和氯膦酸盐，在其结构中不含氮原子，可作为焦磷酸盐的类似物。它们被代谢为ATP 的细胞毒性类似物，腺苷5'-（β，γ-二氯亚甲基）-三磷酸抑制线粒体腺嘌呤核苷酸转运酶（ANT），并最终引发细胞凋亡[7]。第二代和第三代双膦酸盐，其烷基链中含有氮原子，如阿仑膦酸盐或帕米膦酸盐，其效力比第一代双膦酸盐高10～100倍，并显示可通过甲羟戊酸途径抑制骨吸收[8]。该途径是异戊二烯化所必需的，其导致法尼基或香叶基香叶基部分转移至靶蛋白，如Rho、Rac、Ras 或Rab，这对于细胞骨架组织和细胞形态很重要。 如果没有异戊二烯化，破骨细胞的活性就会降低，并发生凋亡[9]。此外，近年来的研究发现，双膦酸盐除具有很强的抗破骨细胞的作用之外，还具有一定的抗肿瘤和抗血管生成作用[10]。

表1 不同双膦酸盐进入美国市场的时间

2 双膦酸盐类药物的临床应用

2.1 骨质疏松症骨质疏松症（Osteoporosis）是一种由于多种原因导致的以骨量低、骨组织微结构损坏，导致骨脆性增加为特征的全身性骨病，患此病者发生骨折的可能性更大[11]，绝经后妇女的发病率最高。治疗骨质疏松症的药物主要有抑制骨吸收药和促进骨形成药两类。双膦酸盐于上世纪70年代和80年代开始用于治疗骨质疏松症[12]。

Iba 等[13]调查了双膦酸盐（阿仑膦酸钠或利塞膦酸盐）对55例绝经后妇女骨质疏松症患者持续治疗10年的疗效，结果表明，腰椎骨密度在过去的10年中持续增加，而整个髋部的骨矿物质密度（BMD）略有下降，而在1/3 半径处的BMD 在过去的10年中没有任何显著变化。开始治疗后血清Ca值显著降低，并且从第二年开始在参考范围内稳定。从开始治疗的第二年起，骨吸收标记物（如uNTX和TRAP5b）显著下降，此后未观察到明显变化。因此，连续使用阿仑膦酸钠或利塞膦酸盐10年可以作为绝经后骨质疏松症患者的治疗选择。其他几项实验研究也证实了阿仑膦酸钠和其他双膦酸盐药物对绝经后妇女骨质疏松症的治疗效果[14，15]。以上临床研究中的双膦酸盐类药物都可以降低绝经后妇女的骨折风险。由于比较研究需要大样本且成本昂贵，因此将来不太可能进行更多此类实验。另外，双膦酸盐类药物也可以与多肽激素类骨调节药和糖皮质激素联合用于中重度的骨质疏松症的治疗[16，17]。

2.2 骨转移和恶性高钙血症骨骼是恶性肿瘤转移的第三大常见部位，研究表明，大约70%的晚期癌症患者会出现骨转移[18]，除转移外，多达30%的癌症患者在其转移过程中会出现高钙血症[19]。临床治疗高钙血症的方式是静脉注射双膦酸盐。破骨细胞活化被认为是骨转移的标志，双膦酸盐具有直接和间接的抗肿瘤特性，以及对骨的高亲和力，被建议用于治疗转移性骨病。Seo 等[20]通过将氨基双膦酸盐与缓激肽拮抗剂BKM-570 缀合而生成BKM1740 化合物，在骨转移模型中这种化合物通过直接抑制survivin 过表达而诱导转移性癌细胞凋亡来抑制肿瘤细胞的生长。

双膦酸盐也可以与抗肿瘤剂和放射性核素缀合来治疗转移性骨病。Herbert 等[21]将氨基双膦酸盐（阿伦膦酸盐，帕米膦酸盐）与核苷类似物5-FdU共价连接，获得结合了两种不同细胞毒性功能的N4-[烷基-（羟基膦酰基）膦酸酯]-胞苷。5-FdU-阿仑膦酸盐（5-FdU-aln）与羟基磷灰石的体外结合显示，与5-FdU 相比，这些BP 的结合增加了6 倍。在一组人类肿瘤细胞系上测试了5-FdU-aln 的细胞毒性，可抑制5%～38%的生长；而在骨转移模型中，与未修饰的母体药物相比，5-FdU-aln 是癌症特异性的寻骨剂。Marija 等[22]制备了一种基于Fe3O4和涂覆两个亲水性配体，二膦酸二甲酯（MDP）和1-羟基乙烷-1,1-二膦酸酯（HEDP），99mTc-双膦酸酯涂层的磁性纳米粒（MNPs），结果显示以99mTc 放射性 标 记 包 被 的MNPs，Fe3O4-MDP MNP和Fe3O4-HEDP MNP 在生理盐水和血清中保持稳定持续24h；闪烁显像研究与离体生物分布研究表明放射性标记的MNP 具有很高的体内稳定性，且肝脏和肾脏摄取显著，可以作为骨靶向纳米剂应用。

3 双膦酸盐官能化的研究与应用

目前，双膦酸盐主要作为骨疾病的一线治疗药物。然而，由于其口服生物利用率低及其严重的不良反应，如下颌骨坏死、肾功能损伤等，限制了其应用。双膦酸盐对骨矿物质的高亲和力可以与荧光素、放射性核素、抗肿瘤药物等缀合，实现向骨的靶向作用。在过去几十年中已经开发了几种缀合策略，确保双膦酸盐较高的体内稳定性，从而在缀合后保留其生物学功能。

3.1 双膦酸盐官能化的成像剂在肿瘤靶向中，荧光素广泛应用于肿瘤的临床前研究，用于示踪肿瘤细胞和肿瘤组织。双膦酸盐与荧光素的缀合已成功用于骨代谢的检测和体内示踪。Robert 等[23]报道由甲状旁腺激素（PTH）治疗引起的加速骨丢失（卵巢切除）（OVX）和合成代谢骨增加的小鼠模型中使用近红外（NIR）荧光标记的帕米膦酸盐检测局部骨矿沉积的变化中发现，与未处理的OVX 对照组相比，使用PTH 治疗的双膦酸盐结合速率常数增加了36 倍。因此，基于荧光标记的帕米膦酸盐监测结合动力学是一种高度敏感、局部特异性的监测骨矿物质沉积变化的方法，有可能应用于人类骨质疏松症和骨转移的治疗。Nimrod 等[24]通过将NIR染料Cy-7 与属于非荧光双磷酸酯纳米粒的N-（3-氨基丙基）甲基丙烯酰胺（APMA）单体单元的伯氨基共价偶联，制备了NIR 荧光交联双磷酸酯纳米粒（MA-Glu-BP）NP。通过与羟基磷灰石的相互作用说明了（MA-Glu-BP）NP 对钙的亲和力。因此，NIR-BP 成像技术未来可以实现术中对骨转移、骨生长和微钙化的成像。

双膦酸盐还可以与放射性核素99mTc，89Sr，186/188Re 等通过螯合作用偶联，用于诊断和治疗的生物学评估。

3.2 双膦酸盐官能化的聚合物纳米粒子聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）制成的可生物降解的纳米颗粒可以用双膦酸盐修饰[25]。如，Elisabetta 等[26]制备了由PLGA 与阿仑膦酸盐（ALN）缀合的聚合物形成的纳米颗粒（NPs）。为了显示ALN 与PLGA结合并产生NP 后，ALN 是否保留抗破骨细胞的特性，比较了其对肌动蛋白环生成、凋亡和I型胶原降解的影响。实验结果表明PLGA-ALN NPs 破坏肌动蛋白形成，诱导凋亡并抑制胶原蛋白降解。因此，PLGA-ALN NPs可能有助于抑制与疾病相关的骨降解。

此外，其他的大分子生物材料，如聚乙二醇（PEG）和聚氧乙烯硬脂基醚（Brij）等，通过缀合不同的双膦酸盐所制备的纳米粒子也已被广泛研究。

3.3 双膦酸盐官能化的脂质体双膦酸盐损害破骨细胞的功能并阻止骨吸收，其机理已被广泛研究。然而，双膦酸盐对成骨细胞分化成软骨细胞和钙沉积的可能作用刚被证实。而且，来自单核细胞谱系的细胞能够刺激成骨细胞增殖。因此，成骨细胞对各种因素的敏感性需要进一步研究。Okada 等[27]制备了脂质体氯膦酸盐，用脂质体氯膦酸盐或来自脂质体氯膦酸盐的条件培养基处理源自骨髓的基质细胞的原代培养物，通过体内实验、实时RT-PCR分析测定显示碱性磷酸酶活性以及Runx2和Dlx5的mRNA 水平均有所增加，并且通过蛋白质印迹分析，从脂质体氯膦酸盐的条件培养基中收集的外泌体中存在RANK 蛋白，总之，这些数据表明成骨细胞分化响应于氯膦酸盐的可溶性RANKL，包含外来体促进的。

在另外两项研究中发现，表面双膦酸盐修饰的脂质体均通过对HA 的吸附能力来考察其靶向性，实验结果表明所制备的脂质体均有骨靶向性，但没有进行体内研究，因此这两种脂质体是否确实在骨骼中分布良好未知[28，29]。

4 其他生物医学用途

双膦酸盐由于其对骨骼的强亲和力，可以作为抑制植入物附近骨吸收的涂层剂。他们可以单独涂覆在钛的表面，也可以涂覆在羟基磷灰石涂层的钛的植入物的表面，因此可以固定植入物在骨骼上[30]。另外，其和金属表面的优异粘合性能相似，双膦酸盐已被作为锚固剂，用于稳定纳米粒子的空间结构[31]。

此外，双膦酸盐可以从体液中除去离子或分子。患有类风湿性关节炎或骨关节炎的患者的滑液中可以发现磷酸钙晶体，评价了用双膦酸盐修饰的市售超顺磁珠（Dynabeads®My One™）从疑似骨关节炎患者的滑液中析出磷酸钙晶体的能力。有报道扫描电子显微镜（SEM）证实了晶体附着在磁珠上[32]。

5 结论与展望

在过去几十年中，双膦酸盐由于其结构的特异性，被用于各种骨疾病的一线治疗，但是由于其口服生物利用率低，因此，探索不同的给药途径，如肺、鼻和透皮等方式，以提高其生物利用度；为减少双膦酸盐副作用的发生，一些制剂新技术也正在不断的研究和探索。双膦酸盐是理想的骨靶向剂，它们对骨组织中高代谢区域中的病理钙化具有高选择性亲和力，目前正在开发针对转移性骨病的骨靶向的治疗。因此，将化疗药物靶向骨组织具有广阔的前景。此外。双膦酸盐作为涂层剂、锚固剂、造影剂等也被广泛应用于骨相关疾病的治疗、成像等方面的研究。将来，双膦酸盐与核因子-κB 配体的受体激活剂的单克隆抗体联合治疗骨质疏松症也不无可能。目前，用于该目的的第一抗体已经在市场上销售。

双膦酸盐除了具有抗破骨细胞的作用外，还具有抗肿瘤的作用，尽管目前研究还处于实验室阶段，但是随着研究的不断深入，其必将在医药领域和临床研究等方面有着广阔的发展前景。