子宫内膜异位症患者子宫内膜HIF-1α、CD34、CD54的表达及相互关系※

贾云波 杜惠兰 姚颖玉 宫学华

(河北省廊坊卫生职业学院中医教研室，河北 廊坊 065001)

子宫内膜异位症患者子宫内膜HIF-1α、CD34、CD54的表达及相互关系※

贾云波 杜惠兰△姚颖玉1宫学华2

(河北省廊坊卫生职业学院中医教研室，河北 廊坊 065001)

目的 观察缺氧诱导因子1α(HIF-1α)、CD34、CD54与子宫内膜异位症(EMS)发生的关系，以期探讨EMS的发病机制。方法 选取26例EMS手术患者，所有病例均经腹腔镜或开腹手术确诊，经病理证实为腹膜型EMS 8例，卵巢子宫内膜异位囊肿9例，子宫腺肌症9例，同期选取子宫肌瘤手术患者6例为对照组，应用免疫组织化学法(SP)测定2组子宫内膜组织中HIF-1α、CD34、CD54的表达。结果 HIF-1α、CD34、CD54在腹膜型EMS组、卵巢子宫内膜异位囊肿组、子宫腺肌症组的表达均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。HIF-1α与CD34、CD54的表达呈正相关。结论 HIF-1α可能在EMS异位病灶形成中起重要作用，推测内异症的发生与局部病灶缺氧有关。且HIF-1α与CD34的表达呈正相关，提示HIF-1α可以促进内异症组织血管生成；HIF-1α与CD54的表达呈正相关，推测HIF-1α可加强异位内膜细胞的黏附作用，从而有利于形成异位灶。

子宫内膜异位症；缺氧诱导因子1,α亚基；抗原,CD34；胞间黏附分子1

子宫内膜异位症(endometriosis，EMS)是育龄期妇女常见病，临床表现为不孕、性交痛、慢性盆腔痛、痛经等，严重影响患者的身心健康[1]。该病的发病机制至今尚未完全阐明。EMS有3种病变形式：腹膜型EMS、卵巢子宫内膜异位囊肿、子宫腺肌症。EMS虽是良性病变，但有恶性生物学行为，乏氧是恶性肿瘤发展过程中的普遍现象。缺氧诱导因子1α(HIF-1α)是乏氧的重要代表因子[2]，在EMS中异位的子宫内膜碎片由于缺乏相应的血管供应，面临缺血、缺氧环境[3]，本研究通过研究乏氧与EMS血管生成、黏附机制的关系，为EMS的发病机制提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 病例选择

1.1.1 诊断标准 符合中华医学会妇产科学分会子宫内膜异位症协作组制订的《子宫内膜异位症的诊治指南》[4]。

1.1.2 纳入标准 ①符合上述诊断标准；②B超检查结果支持，伴有周期性疼痛性交痛以及不孕等临床症状；③经医学伦理会审核通过，获知情同意，自愿参与研究。

1.1.3 排除标准 ①合并盆腔、子宫及其附件慢性炎性疾病；②子宫发育不良或存在恶性病变，如子宫肌瘤、子宫腺肌瘤等。

1.2 一般资料 全部32例均为河北医科大学第二医院(11例)、石家庄市第六医院(11例)、河北省中医院(10例)2012-10—2015-12行妇科手术的住院患者，研究组26例为妇科手术治疗的EMS患者，术后经病理证实为腹膜型EMS 8例，卵巢子宫内膜异位囊肿9例，子宫腺肌症9例；年龄27～48岁，平均(38.83±5.16)岁。对照组选择同期住院的子宫肌瘤患者6例，术后经病理证实为正常子宫内膜，年龄35～47岁，平均(40.63±3.23)岁。全部患者均知情同意，2组年龄分布均衡，比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.3 观察指标及方法

1.3.1 仪器与试剂 HIF-1α兔抗人多克隆抗体为浓缩型工作液(工作浓度1∶100)；CD34鼠抗IgG多克隆抗体、CD54鼠抗IgG多克隆抗体，均购自武汉博士德生物工程有限公司；Nikon尼康光镜显微照相机；LEICA RM2125石蜡切片机。

1.3.2 取材方法 组织取材：手术取分泌期内膜异位症患者异位内膜组织、卵巢子宫内膜异位囊肿囊壁、子宫腺肌症组织5～6 mm大小；对照组取分泌期行手术子宫肌瘤患者的正常子宫内膜组织5 mm大小，立即浸入4%的多聚甲醛固定液中，石蜡包埋，4 μm连续切片做苏木精-伊红(HE)染色。

1.3.3 HIF-1α、CD34、CD54表达 采用免疫组织化学法(SP)测定，免疫组化主要步骤如下：切片常规脱蜡至水；0.01 M磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，每次5 min；0.3%甲醇-过氧化氢室温下孵育20 min；蒸馏水清洗3次，每次5 min；0.1 M枸橼酸缓冲液(pH=6.0)微波炉内修复，98 ℃维持20 min；冷却至室温；10%山羊血清，37 ℃温箱湿盒内孵育30 min；滤纸吸去多余血清，加入一抗(稀释1∶100)；0.01 M PBS清洗3次，每次5 min；滴加生物素化二抗(山羊抗兔)工作液，37 ℃温箱湿盒内孵育30 min；0.01 M PBS清洗3次，每次5 min；滴加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液，37 ℃温箱湿盒内孵育30 min；0.01 M PBS清洗3次，每次5 min；二氨基联苯胺(DAB)显色2～5 min；自来水充分冲洗，终止显色；梯度酒精脱水：70%、80%、90%酒精5 min，95%酒精10 min，100%酒精Ⅰ、Ⅱ各15 min；二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各15 min透明；中性树胶封固，阴性对照用PBS替代一抗；HIF-1α、CD34、CD54均以胞浆、胞核内黄色细颗粒为阳性结果。

1.3.4 阳性细胞图像分析 所有标本均在Motic Med 6.0数码医学图像分析系统内，在相同的放大倍数下，每个切片计数10个视野，分析各指标的表达情况，以指征阳性信号的表达强度。HIF-1α、CD54结果的测定是以灰度值表示,值越低,表达含量越高；CD34的表达以平均光密度值(入射光/出射光，取对数)表示，值越高，含量越高。

1.4 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件进行统计处理，采用成组资料的方差分析；两变量相关关系用直线相关分析，以Spearman相关系数表示,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组子宫内膜HIF-1α、CD34、CD54表达情况 见表1。

由表1可见，HIF-1α、CD34、CD54在腹膜型EMS组、卵巢子宫内膜异位囊肿组、子宫腺肌症组的表达均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 HIF-1α在各组内膜组织中的表达 HIF-1α阳性表达呈棕黄色颗粒，主要定位于腺体胞浆或胞核中，HIF-1α在腹膜型EMS组、卵巢巧克力囊肿组及子宫腺肌症组异位内膜及间质中均有表达，HIF-1α在以上3组的表达均高于对照组。见图1。

表1 各组子宫内膜HIF-1α、CD34、CD54表达情况

与对照组比较，*P<0.05

对照组 卵巢子宫内膜异位囊肿组 子宫腺肌症组 腹膜型EMS组
图1 HIF-1α在各组的表达(×400)

2.2 CD34在各组内膜组织中的表达 CD34的阳性表达在新生血管内皮细胞的胞浆中，对照组新生血管少，在卵巢子宫内膜异位囊肿组、子宫腺肌症组、腹膜型EMS组新生血管多，CD34在以上3组的表达均高于对照组。见图2。

对照组 卵巢子宫内膜异位囊肿组 子宫腺肌症组 腹膜型EMS组
图2 CD34在各组的表达(×200)

2.3 CD54在各组内膜组织中的表达 CD54阳性表达在腺体细胞胞浆中,对照组阴性表达。子宫腺肌症组表达呈弱阳性，卵巢子宫内膜异位囊肿组及腹膜型EMS组除在腺体表达外,在血管内皮细胞中也有表达,CD54在以上3组的表达均高于对照组。见图3。

对照组 卵巢子宫内膜异位囊肿组 子宫腺肌症组 腹膜型EMS组
图3 CD54在各组的表达(×400)

2.4 两变量相关 用直线相关分析，以Spearman相关系数表示,结果示:HIF-1α与CD34的表达呈正相关(r=0.873)、P=0.01(双侧)；HIF-1α与CD54的表达呈正相关(r=0.857)、P=0.01(双侧)。

3 讨 论

EMS为育龄期妇女常见病，其病因尚不完全清楚。EMS虽是一种良性病变，但有恶性肿瘤的生物学特征，其发病机制至今仍存在争议。异位灶形成有3个步骤：黏附、侵袭、血管生成[5]，异位内膜必须持续存活足够长的时间才能完成该过程，在此过程的早期，细胞必然处于一个缺血、缺氧的环境。Sharkey等[6]体外研究证实低氧可作为独立的因素调节血管内皮生长因子(VEGF)的产生。Smith SK[7]也认为月经期脱落的子宫内膜本身处于缺氧状态。

研究证实HIF-1α在维持肿瘤细胞的能量代谢、新生血管形成、细胞增殖等方面起重要作用[8]。在肿瘤发生早期可发生HIF-1α的过度表达，且与肿瘤血管形成、侵袭转移有关[9]。HIF-1α在EMS的形成和发展中是否起到一定作用，值得我们探索。HIF-1α是机体处于缺氧状态的惟一调控因子，调控参与血管生成的各种因子，可促进EMS异位内膜的生长[10]。缺氧使HIF-1α表达增强，激活一系列靶基因的转录，使细胞获得对组织低氧和营养物质供应减少的适应能力，维持细胞的生存与增殖[11]。Sharkey等[6]提出缺氧条件下促进大量新生血管的形成可能是EMS的发病机制之一。有研究发现，在EMS患者在位子宫内膜组织中，HIF-1α的表达较正常子宫内膜升高，在微观上已具有与正常内膜不同的生物学特性，此结果符合“在位内膜决定论”[12]。近年来大量研究发现EMS与血管生成关系密切[13]，从而提出一个新的病因学说：血管形成学说。

CD34抗体最常用来标记肿瘤血管内皮细胞，新近国内外报道显示，以CD34标记血管内皮细胞的特异性最强[14]。Donnez等[15]认为EMS红色病变中血管生成及有丝分裂活性最高，表明在异位灶形成早期组织内新生血管更丰富，有利于病灶浸润、发展。本研究结果显示，CD34在腹膜型EMS组、卵巢子宫内膜异位囊肿组及子宫腺肌症组的表达均明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

CD54参与细胞的生长移行、肿瘤的转移浸润、血管生成等一系列的生理、病理过程[16]，可作为EMS黏附机制的代表因子。黏附分子的高表达均有助于异位组织逃避机体免疫系统和自然杀伤细胞的杀伤，对异位组织侵入腹膜、卵巢等起促进作用[17]。本研究结果显示，CD54在腹膜型EMS组、卵巢子宫内膜异位囊肿组及子宫腺肌症组的表达均明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

综上所述，本研究EMS患者子宫内膜组织HIF-1α高于正常子宫内膜组，提示EMS的形成可能与乏氧关系密切。HIF-1α与CD34的表达呈正相关，提示HIF-1α可以促进EMS组织血管生成；HIF-1α与CD54的表达呈正相关，推测HIF-1α可加强异位内膜细胞的黏附作用，从而有利于形成异位灶。

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(本文编辑：李珊珊)

The expression and correlation of HIF-1α, CD34 and CD54 in endometrium of patients with endometriosis

JIAYunbo*,DUHuilan,YAOYingyu,etal.

*DepartmentofTeachingandResearchofTraditionalChineseMedicine,LangfangHealthVocationalCollegeinHebeiProvince,Hebei,Langfang065001

Objective To observe the relationship between hypoxia-inducible factor 1 alpha (HIF-1α), CD34, CD54 and endometriosis (EMS), in order to explore the pathogenesis of EMS.Methods 26 EMS surgery patients were selected, all cases were diagnosed by laparoscopy or laparotomy. Confirmed by pathology, 8 cases were peritoneal EMS, 9 cases were ovarian endometriosis cyst and 9 cases were adenomyosis. Six patients with uterine fibroids surgery were selected as control group at the same time. The expression of HIF-1α, CD34, CD54 in endometrial tissues were detected by streptavidin-perosidase (SP) in two groups. Results The expression of HIF-1α, CD34, CD54 in peritoneal EMS group, ovarian endometriosis cyst group and adenomyosis group was higher than that in control group, with statistical difference (P<0.05). HIF-1α was positively correlated with the expression of CD34 and CD54. Conclusion HIF-1α may play an important role in the formation of EMS ectopic lesions,speculating that the occurrence of endometriosis related to hypoxia in local lesions. Moreover, HIF-1α was positively correlated with the expression of CD34 suggesting that HIF-1α can promote angiogenesis in EMS tissue. HIF-1α was positively correlated with the expression of CD54 suggesting that HIF-1α can enhance the adhesion of ectopic endometrial cells, thus which is conducive to the formation of ectopic lesions.

Endometriosis; Hypoxia-inducible factor 1, alpha subunit; Antigen, CD34; Intercellular adhesion molecule 1

10.3969/j.issn.1002-2619.2017.07.008

※ 项目来源：河北省科学技术厅科技计划项目(编号：132777155)；河北省中医药管理局科研计划项目(编号：2014027)

△ 通讯作者：河北中医学院妇科教研室，河北 石家庄 050091

1 中国石油天然气集团公司中心医院中医科，河北 廊坊 065000

2 中国石油天然气集团公司中心医院门诊部，河北 廊坊 065000

贾云波(1982—)，女，主治医师，博士。研究方向：生殖与内分泌专业。

R711.71

A

1002-2619(2017)07-0992-05

2017-01-17)