纳米氧化锌对小鼠腹腔巨噬细胞Ana-1的毒性作用及机制

褚天雪，邢立国，袁娟，戴维，王媛，龙新宇，刘亭，左代英，吴英良

（1.沈阳药科大学生命科学与生物制药学院，辽宁沈阳110016；2.沈阳化工研究院安全评价中心，辽宁沈阳110021）

纳米氧化锌对小鼠腹腔巨噬细胞Ana-1的毒性作用及机制

褚天雪1，邢立国2，袁娟1，戴维1，王媛1，龙新宇1，刘亭1，左代英1，吴英良1

（1.沈阳药科大学生命科学与生物制药学院，辽宁沈阳110016；2.沈阳化工研究院安全评价中心，辽宁沈阳110021）

目的 研究纳米氧化锌（ZnO-NP）对小鼠腹腔源巨噬细胞（Ana-1）的毒性作用及机制。方法ZnO-NP 2.5～160 mg·L-1与Ana-1细胞作用24 h后，MTT法检测Ana-1细胞的存活率；吖啶橙-溴化乙锭（AO-EB）染色及流式细胞术观察Ana-1细胞凋亡；流式细胞术检测细胞对ZnO-NP的摄取；锌离子荧光探针测定细胞内的锌离子；乙二胺四乙酸（EDTA）螯合锌离子，检测细胞存活率。结果 ZnO-NP在2.5，5，10和20 mg·L-1浓度范围内能够浓度依赖性地抑制Ana-1细胞存活（r=0.905，P＜0.05）；ZnO-NP 20 mg·L-1组细胞存活率为细胞对照组的27.9%，细胞出现明显的凋亡样改变；ZnO-NP 40，80和160 mg·L-1组细胞摄取的ZnO-NP比细胞对照组显著增加（P＜0.05）；EDTA 2.5 mmol·L-1能够明显降低细胞内的自由锌离子，改善ZnO-NP 10 mg·L-1引起的细胞存活率下降（P＜0.05）。螯合锌离子后，ZnO-NP对Ana-1细胞的毒性明显降低（P＜0.05）。结论ZnO-NP可浓度依赖性增加Ana-1细胞的毒性，引起凋亡样改变，其毒性可能与其进入细胞并释放锌离子有关。

纳米；氧化锌；Ana-1细胞；细胞毒性

随着纳米科技的迅速发展，纳米材料被越来越广泛地应用于各个领域。纳米氧化锌（zinc oxide nanoparticles，ZnO-NP）是一种应用前景广泛的多功能无机纳米材料，其具有粒径微小、比表面积大和化学性质稳定等特点，被广泛应用于化妆品、电子产品、药物载体、治疗和诊断等各个领域［1-3］，ZnO-NP对人类健康的潜在影响也日益引起人们关注。ZnO-NP具有一般普通微米级ZnO所无法比拟的性能和用途。然而，随着ZnO-NP的广泛应用，其安全性也越来越受到研究人员的广泛重视。ZnO-NP一旦进入生物体，与细胞膜作用形成微孔，或直接进入某些细胞器甚至细胞核内，产生一定的生物毒性［4］。

巨噬细胞作为免疫系统的一部分，以不同形式广泛分布于人体不同部位，在体液免疫和细胞免疫中发挥重要作用。受外界刺激后，巨噬细胞会产生一系列反应，吞噬外来物质，同时巨噬细胞本身也与免疫反应和炎症反应有关，并分泌一系列活性物质［5］。小鼠腹腔巨噬细胞Ana-1细胞，被广泛用于免疫毒性相关的研究中［6-8］。有研究表明，ZnO-NP有较强的体内毒性和体外细胞毒性；ZnO-NP可引起小鼠明显的肝、肺、肾和脑等器官的氧化应激及病理损伤［9-14］；ZnO-NP也能够引起人肺上皮细胞、小鼠成纤维细胞、大鼠肾上皮细胞和人单核细胞等的明显细胞毒性改变［15-18］。大量研究都表示，ZnO-NP对细胞生长有极强的抑制作用，且明显高于其他类金属氧化物的纳米颗粒［19-24］；在不同浓度ZnO-NP对人体主动脉细胞内皮的毒性效应的研究中，纳米颗粒出现内在化进入细胞的现象，ZnO-NP 50 mg·L-1有细胞毒性，可导致大量细胞死亡，但关于细胞死亡的机制尚不清楚，需进一步研究［25］。

ZnO-NP可通过呼吸道、消化道和皮肤等多种途径进入人体，并能通过体循环分布到各组织中。进入机体的ZnO-NP作为外来异物可能会引起机体特异性免疫反应。然而，尚无关于ZnO-NP对小鼠腹腔巨噬细胞Ana-1的毒性及相关机制研究报道。因此，为探讨ZnO-NP对正常免疫细胞的潜在影响，研究ZnO-NP对小鼠腹腔巨噬细胞Ana-1细胞的毒性及其机制，旨在为ZnO-NP的安全性评价提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂和仪器

Ana-1细胞购自中国中科院上海生物细胞所，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基在37℃，5%CO2培养箱中培养，每天换液1次，培养至细胞融合70%～80%以上，倒置显微镜观察细胞生长情况，传代培养，取对数生长期细胞用于实验。

RPMI 1640培养基（批号：1663936），购自美国Gibco公司；胎牛血清（批号：09087213-2272），购自中国天津市灏洋生物制品科技有限责任公司；96孔板（批号：701001）购自中国NEST公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT，批号：705B054），购自美国Sigma公司；吖啶橙-溴化乙锭（acridine orange-ethidium bromide，AO-EB，批号：20151023）染料和碘化丙啶（propidium iodide，PI，批号：C0080），均购自中国索莱宝公司；ZnO-NP（50 nm），购自中国皓田纳米科技有限公司；Zinquin ethyl ester探针（批号：JM829），购自日本同仁化学研究所。

1.2 ZnO-NP悬液的制备

ZnO-NP在使用前经183℃干热灭菌3 h。灭菌后的ZnO-NP用无血清RPMI 1640培养基（pH 7.3）配成悬液。加ZnO-NP悬液前，用超声波仪超声30 min，以防ZnO-NP产生凝聚现象。

1.3 MTT法检测细胞存活率

将计数后的细胞悬液（4×108L-1）加入96孔板，每孔3.2×104个细胞，分为ZnO-NP 2.5，5，10，20，40，80和160 mg·L-1组和不加ZnO-NP的正常细胞对照组，各组设3复孔，待细胞与ZnO-NP共孵育24 h后，取出96孔板，每孔加入20 μL MTT（5 g·L-1），4 h后每孔加入100 μL三联液（5 mL异丁醇，10 g SDS，0.1 mL HCl 10 mol·L-1），过夜后，用多功能酶标仪测量570和630 nm处的吸光度值（A）。采用双波长法计算细胞存活率。细胞存活率（%）=（处理组A570nm-处理组A630nm）/（对照组A570nm-对照组A630nm）×100%。

1.4 流式细胞术检测Ana-1细胞对ZnO-NP的摄取

纳米颗粒被细胞摄取后，细胞会由于吞噬行为内部结构变复杂，细胞所摄取的纳米颗粒与细胞内结构的复杂程度正相关，流式细胞仪检测侧向散射（SSC）与细胞内颗粒结构呈近直线关系。细胞内颗粒越复杂，其SSC越大，细胞摄取的颗粒越多。取对数生长期Ana-1细胞，吹打、重悬、计数后，以1×109L-1的密度接种于6孔板，分为ZnO-NP 10，20，40，80或160 mg·L-1组和不加ZnO-NP的细胞对照组，4 h后收集细胞。472×g离心5 min，重悬，上样，计数1×104个细胞，数据采用Cell Quest软件（Becton Dickison）进行分析处理。

1.5 AO-EB染色法检测细胞膜完整性

取对数生长期Ana-1细胞，吹打、重悬、计数后，以1×109L-1的密度接种于24孔板中，根据MTT结果 ，使用ZnO-NP 40 mg·L-1与Ana-1细胞共孵育24 h，收集细胞。每孔加入200 μL AO-EB应用液（5 mg·L-1），避光孵育5 min，118×g离心5 min，弃上清，加入PBS重悬，吸取50 μL滴于载玻片上，盖上盖玻片，于荧光显微镜下观察。AO能透过完整细胞膜并嵌入细胞核DNA，使之发出亮绿色荧光，而EB仅能透过细胞膜受损的细胞，嵌入DNA后发出橘黄色荧光。

1.6 PI染色法检测细胞凋亡

取对数生长期Ana-1细胞，吹打、重悬和计数后，以1×106L-1的密度接种于6孔板中，分为ZnO-NP 10，20，40和80 mg·L-1组和不加ZnO-NP的细胞对照组，作用48 h后收集细胞。472×g离心10 min，弃上清，加入500 μL的PBS，混匀。再加入10 mL 70%冰乙醇，-20℃保存，实验前1天置于4℃预冷。472×g离心10 min，弃上清。PBS重悬，洗涤3次，上样，计数10 000个细胞，数据采用Cell Quest软件（Becton Dickison）进行分析处理。PI是一种DNA荧光染料，结合DNA后发出荧光，以流式细胞仪进行测量，可得出细胞内DNA含量分布情况，亚G1期是细胞凋亡的特征之一，由此分析细胞凋亡。

1.7 荧光探针法检测细胞内自由锌离子

按1.5处理细胞，作用4 h后收集细胞。472×g离心5 min，加入锌离子荧光探针悬液，终浓度为2.4 μmol·L-1，避光、共孵育30 min，用无血清RPMI 1640培养基洗3次，然后加入50 μL封片剂，混匀，滴于载玻片上，盖上盖玻片，操作过程避免振动。于共聚焦显微镜下观察。zinquin ethyl ester具有膜通透性，自身也有荧光，但它自身的荧光强度几乎可忽略不计，被细胞内的酯酶剪切，从而被滞留在细胞内，结合锌离子后在紫外激发下发蓝色荧光。

1.8 EDTA螯合锌离子MTT法检测细胞存活

使用乙二胺四乙酸（ethylene diamine tet-raacetic acid，EDTA）2.5，5，10和20 mmol·L-1分别与ZnO-NP 0，10，20，40和80 mg·L-1共孵育Ana-1细胞24 h，MTT法检测细胞存活，采用双波长法计算细胞存活率。

1.9 统计学分析

实验结果 数据均用x±s表示，使用SPSS 13.0软件对实验数据进行单因素方差分析（one-way ANOVA），方差齐时用LSD法，方差不齐时用Dunnettt法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ZnO-NP对细胞存活率的影响

Ana-1细胞与ZnO-NP 2.5，5，10和20 mg·L-1共同孵育24 h后，细胞的存活率随ZnO-NP浓度的增加呈浓度依赖性地降低（r=0.905，P＜0.05）（图1）。ZnO-NP 20 mg·L-1组细胞存活率下降至细胞对照组的27.9%，ZnO-NP浓度≥40 mg·L-1时，细胞存活率＜14.5%。

Tig.1 Effect of zinc oxide nanoparticles（ZnO-NPs）on viability of Ana-1 cells by MTT assay.Ana-1 cells were incubated with ZnO-NPs 2.5，5，10，20，40，80 and 160 mg·L-1for 24 h.x±s，n=3.＊P＜0.05 compared with cell control（0）group.

2.2 ZnO-NP对Ana-1细胞摄取能力的影响

Ana-1细胞摄取ZnO-NP结果 如图2所示，与细胞对照组比较，ZnO-NP 40，80和160 mg·L-1组摄取ZnO-NP的细胞百分率显著增多（P＜0.05）。ZnO-NP 10和20 mg·L-1组摄取ZnO-NP细胞的百分率与细胞对照组无显著差异。

2.3 ZnO-NP对Ana-1细胞膜完整性的影响

AO染色结果 （图3）显示，细胞对照组细胞核呈现为均匀的绿色，位于细胞中央，EB基本未见着色；而ZnO-NP 40 mg·L-1组可见细胞核发出明亮的绿色荧光，部分细胞被EB染色，表现为橘红色荧光增强，提示细胞膜完整性被破坏，凋亡及坏死细胞逐渐增多。

Fig.2 Effect of ZnO-NP on uptake of Ana-1 cells.Ana-1 cells were incubated with ZnO-NPs 10，20，40，80 and 160 mg·L-1for 4 h.x±s，n=3.＊P＜0.05，compared with cell control（0）group.

Fig.3 Effect of ZnO-NPs on integrity of cell membrane of Ana-1 cell by AO-EB staining.Ana-1 cells were incubated with ZnO-NPs 40 mg·L-1for 24 h.Arrows show cells stained by ethidium bromide（EB）.

2.4 ZnO-NP对Ana-1细胞凋亡的影响

流式细胞仪检测结果 （图4）显示，与细胞对照组相比，ZnO-NP 20，40和80 mg·L-1组亚G1期细胞数明显增多（r=0.776，P＜0.05），提示ZnO-NP能够诱导Ana-1细胞凋亡，产生明显的毒性反应。

Fig.4 Effect of ZnO-NPs on Ana-1 cell number at sub-G1by flow cytometry.Ana-1 cells were incubated with ZnO-NPs for 48 h.x±s，n=3.＊P＜0.05，compared with cell control（0）group.

2.5 ZnO-NP对细胞内锌离子的影响

细胞内自由锌离子检测结果 （图5）显示，细胞对照组细胞内未检测到自由锌离子；加入ZnO-NP 40 mg·L-14 h后细胞内检测到自由锌离子；提示ZnO-NP可被Ana-1细胞摄取，并在细胞内释放出自由锌离子。

Fig.5 Effect of ZnO-NPs on intracellular free zinc ion of Ana-1 cells by zinquin ethyl ester.Ana-1 cells were incubated with ZnO-NPs 40 mg·L-1for 4 h.

2.6 EDTA螯合锌离子后ZnO-NP对细胞存活率的影响

EDTA 2.5和5 mmol·L-1能够明显改善ZnO-NP 10 mg·L-1所引起的细胞存活率下降（P＜0.05）。EDTA 10 mmol·L-1能够明显改善ZnO-NP 20 mg·L-1所引起的细胞存活率下降（P＜0.05），而EDTA 20 mmol·L-1能够明显改善ZnO-NP 10，20和40 mg·L-1所引起的细胞存活率下降（P＜0.05）（图6）。提示ZnO-NP在细胞内产生的锌离子是ZnO-NP对细胞产生毒性的主要途径之一。

Fig.6 Effect of ZnO-NPs on viability of Ana-1 cells after chelating zinc ions with EDTA by MTT assay.Ana-1 cells were incubated with ZnO-NPs and EDTA for 24 h.x±s，n=3.＊P＜0.05，compared with ZnO-NPs only group.

3 讨论

本研究结果 表明，ZnO-NP随着浓度增加，对细胞产生的毒性也逐渐加大，表现为细胞存活率降低，这与文献中报道的ZnO-NP对细胞具有极强的抑制作用一致［19-24］。AO-EB染色和PI单染流式细胞术检测结果 显示，ZnO-NP作用Ana-1细胞后，均出现明显的凋亡样改变。流式细胞术测定细胞摄取ZnO-NP颗粒的结果 表明，细胞内ZnO-NP颗粒浓度依赖性增多，这与MTT法测定不同浓度ZnO-NP对细胞存活率影响的趋势一致；随着细胞内ZnO-NP颗粒的增加，产生的毒性也显著升高。文献报道，纳米颗粒在体外和体内条件下都易被摄入细胞膜，从而影响细胞功能［26］，这与本研究的流式细胞术测定细胞摄取ZnO-NP颗粒的结果 一致。同时，检测细胞内自由锌离子时，只有加入ZnO-NP组可检测到锌离子，未加ZnO-NP的对照组则无法检测到锌离子的存在，提示ZnO-NP颗粒会在介质中解离出锌离子，并进入细胞内。当采用EDTA螯合介质中的锌离子时，ZnO-NP产生的毒性明显降低，提示ZnO-NP可能通过介质中解离出的自由锌离子产生细胞毒性。已有研究表明，解离的锌离子是纳米氧化锌颗粒产生毒性作用的原因，这个观点在本研究的结果 中得到印证［27］。

AO-EB染色与PI单染流式细胞术的结果 共同表明，ZnO-NP可诱导细胞凋亡。在ZnO-NP暴露24 h后，AO-EB染色结果 出现凋亡样改变，但仅有少量细胞出现细胞凋亡现象。在PI单染流式细胞术结果 中，ZnO-NP暴露48 h后，细胞出现显著的凋亡现象。这可能是由于ZnO-NP通过多种方式诱导细胞死亡，如接触初期主要通过其他途径诱导细胞死亡，ZnO-NP长时间暴露才会诱导细胞凋亡。ZnO-NP是通过何种途径诱导细胞死亡，尚有待于进一步研究。

综上所述，ZnO-NP在低浓度时产生的毒性较小，当浓度40 mg·L-1时产生明显的细胞毒性，所以在ZnO-NP的应用过程中，应注意ZnO-NP使用剂量的安全范围。ZnO-NP确实对免疫细胞产生毒性，且随着暴露浓度增大而加大。同时，ZnO-NP产生毒性的机制可能与细胞摄取纳米颗粒的量和ZnO-NP解离出自由锌离子的量有关。

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Cytotoxicity and mechanism of zinc oxide nanoparticles on murine macrophage Ana-1 cells

CHU Tian-xue1,XING Li-guo2,YUAN Juan1,DAI Wei1,WANG Yuan1,LONG Xin-yu1,
LIU Ting1,ZUO Dai-ying1,WU Ying-liang1
(1.College of Life Science and Biopharmaceuticals,Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016,China;2.Safety Evaluation Center of Shenyang Research Institute of Chemical Industry Ltd.,Shenyang 110021,China)

OBJECTIVETo study the toxicity of zinc oxide nanoparticles(ZnO-NPs)on murine macrophage Ana-1 cells and the mechanism.METHODSAna-1 cells were incubated with ZnO-NP (2.5-160 mg·L-1).Cell viability was investigated by MTT assay.The integrity of cell membrane was investigated by acridine orange-ethidium bromide(AO-EB)staining.The intracellular uptake of ZnO-NP and the percentage of sub-G1of Ana-1 cells were detected by flow cytometry.Zinc ions were determined by fluorescent probe.The change of cell viability was studied after chelating zinc ions with ethylene diamine tetraacetic acid(EDTA).RESULTSZnO-NP 2.5,5,10 and 20 mg·L-1decreased cell viability of Ana-1 cells(r=0.905,P＜0.05)in a concentration-dependent manner.The cell viability was decreased to 27.9%after exposure to ZnO-NP 20 mg·L-1.Intracellular uptake of ZnO-NP was increased after Ana-1 cell incubated with ZnO-NP at concentrations ranging from 40 to 160 mg·L-1(P＜0.05).There were obvious free zinc ions in the cells.EDTA 2.5 mmol·L-1significantly increased the cell viability decreased by ZnO-NP 20 mg·L-1(P＜0.05).Chelating free zinc ions significantly mitigated ZnO-NP induced cell toxicity (P＜0.05).CONCLUSIONCytotoxicity and apoptosis of Ana-1 cells induced by ZnO-NP might be related to intracellular uptake of ZnO-NP and release of zinc ions.

nanoparticles;zinc oxide;Ana-1 cells;cytotoxicity

The project supported by National Science and Technology Major Project of China(2013ZX09302304); and Liaoning Province Undergraduate Training Program for Innovation and Entrepreneurship(125010128)

ZUO Dai-ying,E-mail:zuodaiying@163.com;WU Ying-liang,E-mail:yingliang_1016@163.com

R99

A

1000-3002-（2017）06-0636-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.06.020

2016-04-22接受日期：2017-05-23）

（本文编辑：贺云霞）

国家科技重大专项（2013ZX09302304）；辽宁省大学生创新创业训练计划项目（125010128）

褚天雪，女，硕士研究生，主要从事纳米材料的毒性研究。

左代英，E-mail:zuodaiying@163.com;吴英良，E-mail:yingliang_1016@163.com