4种5-HT4受体激动剂对大鼠心肌IK1通道的影响及促心律失常风险比较

刘清华＊，李瑜＊，曹晓娜，张莉，翟旭雯（.山西医科大学，山西太原0000；.北京体育大学医院，北京00084；.山西省儿童医院，山西太原000）

4种5-HT4受体激动剂对大鼠心肌IK1通道的影响及促心律失常风险比较

刘清华1＊，李瑜2＊，曹晓娜2，张莉3，翟旭雯1（1.山西医科大学，山西太原030001；2.北京体育大学医院，北京100084；3.山西省儿童医院，山西太原030013）

目的 比较4种5-羟色胺4型（5-HT4）受体激动剂西沙必利（cisapride），扎考必利（zacopride），莫沙必利（mosapride）和2〔1-（4-胡椒基）哌嗪〕基苯并噻唑{2-〔1-（4-Piperonyl）piperazinyl〕benzothiazole，BZTZ}对大鼠心室肌细胞膜内向整流钾通道（IK1）功能和蛋白表达的影响，并观察其对大鼠离体心脏心律的影响，从而评估其致心律失常的风险。方法应用全细胞膜片钳技术分别观察4种激动剂对胶原酶分解的成年SD大鼠心室肌细胞膜IK1和HEK293细胞异源表达的Kir2.1通道电流的影响。应用免疫印迹法检测4种激动剂孵育大鼠心室肌细胞24 h后IK1主要亚单位Kir2.1通道蛋白表达的变化。将麻醉大鼠的心脏取出进行Langendorff主动脉逆行灌流，分别观察4种激动剂给药30 min内离体心脏节律的变化，全程记录心电图。结果 在大鼠心室肌细胞，BZTZ，西沙必利和莫沙必利0.1～10 μmol·L-1可浓度依赖性地抑制IK1。在相同浓度（1 μmol·L-1）时，BZTZ对IK1的抑制效应最强（P＜0.01），其次为西沙必利，莫沙必利最弱。扎考必利可激动IK1（P＜0.01）。在Kir2.1重组质粒转染HEK293细胞，扎考必利激动Kir2.1通道电流（P＜0.01），而莫沙必利无明显影响。在大鼠离体心脏，BZTZ和西沙必利1 μmol·L-1可引起严重的心律失常，期前收缩数分别达到159±28和（61±13）次（P＜0.01），室速发生率分别为50%（P＜0.05）和25%，室颤发生率分别为37.5%和12.5%。莫沙必利和扎考必利对心律均无明显影响，不引起心律失常的发生。扎考必利还可抑制西沙必利和BZTZ诱发的心律失常。4种激动剂的促心律失常风险等级依次为BZTZ＞西沙必利＞莫沙必利和扎考必利。结论IK1可能作为5-HT4受体激动剂致心律失常副作用的独立风险因子和筛选安全5-HT4受体激动剂和促胃肠动力药的新靶点。

内向整流钾通道；心律失常；5-羟色胺4型受体；促胃肠动力药

DOl：10.3867/j.issn.1000-3002.2017.06.006

严重心律失常是心脏病患者的主要死因之一，利用药物预防和治疗心律失常是降低心律失常患者死亡率、提高心脏病患者生活质量的主要手段之一。心肌离子通道的异常及由此引发的动作电位形态的变化往往是心律失常的形成机制和药物研发的靶点。2013年，美国FDA提出了综合体外致心律失常分析（comprehensive in vitro proarrhythmia assay，CiPA）的策略［1］。通过研究药物对人心肌细胞多个离子通道和动作电位的影响，辅以计算机模拟整合，最后结合临床Ⅰ期研究中对人体心电图的评估，构成完整的CiPA策略。这一策略的核心和基础即在于研究药物对心脏多个离子通道功能的影响。根据美国安全药理学会心脏离子通道工作组（Ion Channel Working Group）的建议，目前纳入检测的离子通道有7个，分别是可引起去极化的内向电流钙电流（ICa-L）、电压依赖性快钠电流（INaFast）和晚钠电流（INaLate），及参与复极化的外向电流快速延迟整流钾电流〔ether-a-gogo（hERG）电流，IKr〕、缓慢延迟整流钾电流（IKs）、瞬时外向钾电流（Ito）和内向整流钾电流（inward rectifier potassium current，IK1）［2］。

5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）又称血清素，通过与相应受体结合产生中枢或外周效应。目前临床应用的促胃肠动力药如西沙必利（cisapride）、替加色罗（tegaserod）、普卡必利（prucalopride）和莫沙必利（mosapride）等都属于5-HT 4型受体（5-HT4）激动剂，用于治疗胃轻瘫、胃食管返流以及慢性便秘等多种消化道症状［3］，但是这类药物的致心律失常副作用也引起了普遍担忧。西沙必利和替加色罗由于严重的心律失常甚至致死性尖端扭转型室性心动过速等逐渐增多的心脑血管事件已先后退出市场［4-5］。这促使许多学者开始研究5-HT4受体激动剂与心脏功能和节律的关系，试图揭示其电生理机制。已有研究表明，西沙必利的致心律失常作用与其阻断延迟整流钾通道（IK）有关。IK由人类ether-a-gogo（hERG）K+通道基因编码。Potet等［6］对4种不同的5-HT4受体激动剂西沙必利、普卡必利、伦扎必利和莫沙必利对克隆的人心肌hEGG通道的作用进行研究，并比较了它们致心律失常的潜力。结果 发现，这些药物对人心肌hERG K+通道具有不同的亲合力，西沙必利对hERG的阻断作用最强，他们认为促胃肠动力药物对hEGG通道的亲和力是其致心律失常的风险因子，那些没有阻断hERG电流副作用的5-HT4受体激动剂可作为西沙必利安全的替代品。

扎考必利和西沙必利同属5-HT4受体激动剂，两者化学结构相似（图1）。与西沙必利显著的促心律失常副作用不同，扎考必利对心律和心功能均无明显影响。探究其离子机制，西沙必利明显抑制大鼠心室肌IK1，而扎考必利则可选择性激动IK1，其对ICa-L，INa，Ito，IKr，IKs，ATP敏感钾电流（IKATP）、钠钙交换电流（INXC）和Na+-K+泵电流（Ipump）等影响心肌细胞动作电位的主要膜电流无明显影响［7］。我们设想，IK1的变化会否和hERG通道相似，与药物的致心律失常风险存在内在联系，IK1通道能否作为体外筛选安全促胃肠动力药提供新靶点。为此，我们进一步扩大药物检测范围，增加了两种5-HT4受体激动剂：莫沙必利（mosapride）和2〔1-（4-胡椒基）哌嗪〕基苯并噻唑{2-〔1-（4-piperonyl）piperazinyl〕benzothiazole，BZTZ}，这两者同时具有5-HT4受体激动剂和5-HT3受体阻断剂的效应，与扎考必利的受体作用非常相似。此外，为了避免药物对IK的影响从而干扰实验结果 ，选择SD大鼠作为实验动物，因为大鼠心肌细胞膜表面缺乏功能性IK。应用全细胞膜片钳技术观察上述4种药物对心室肌细胞IK1功能和蛋白表达的影响，并观察它们对大鼠离体心脏心律的影响，从而判断IK1能否作为5-HT4受体激动剂致心律失常副作用的风险因子，为筛选安全促胃肠动力药提供新靶点。

1 材料与方法

1.1 动物、药物、试剂和仪器

健康成年SD大鼠购自军事医学科学院实验动物中心，No.0025371，雄性，220～250 g。

莫沙必利、BZTZ、西沙必利和扎考必利购自美国Tocris公司。小鼠抗人IK1（Kir2.1）单克隆抗体（SAB5200027，批号1205）、牛磺酸、4-氨基吡啶（4-AP）、三磷酸腺苷二钾盐（ATP-K2）、三磷酸腺苷镁盐（ATP-Mg）、L-谷氨酸、EGTA和HEPES（美国Sigma-Aldrich公司）；胶原酶P（德国Bochringer Mannhein公司）；Lipofectamine 2000试剂盒（北京英骏生物技术有限公司）；二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG多抗（美国Sigma-Aldrich公司）；其余为国产分析纯。

Fig.1 Structures of four 5-hydroxytryptamine type 4（5-HT4）receptor agonists.

超纯水配置台氏液（mmol·L-1）：NaCl 140，KCl 5.4，NaH2PO40.33，HEPES 5.0，葡萄糖10，MgCl21.0，CaCl21.8，用NaOH调节PH至7.38。酶液为50 mL无钙台氏液中加入胶原酶3.5～5 mg，牛磺酸125 mg。KB液（mmol·L-1）：KOH 85，L-谷氨酸50，KCl 30，牛磺酸20，KH2PO430，MgCl21.0，HEPES 10，葡萄糖10，EGTA 0.5，用KOH调节PH至7.4。IK1电极内液成分（mmol·L-1）：KCl 150，HEPES 5，EGTA 5.0，ATP-K23.0，MgCl21.0，4-AP 5.0，ATP-Mg 1.0，用KOH调节PH至7.3；细胞外液在台氏液中加入CdCl20.5 mmol·L-1阻断ICa-L电流。Kir2.1通道电流，细胞外液（mmol·L-1）：NaCl 136，KCl 5，CaCl21.8，MgCl21.0，葡萄糖10，HEPES 10，用NaOH调节pH至7.4。电极内液（mmol·L-1）：KCl 40，天冬氨酸钾80，KH2PO410，磷酸肌酸3，EGTA 5，HEPES 5，ATP-Mg 5，用KOH调节pH至7.2。

Langendorff灌流装置，澳大利亚AD Instruments公司；荧光倒置显微镜，日本Olympus公司；微电极拉制仪，日本Narishige公司；Axopatch 200B膜片钳放大器和Digidate 1322A模数转换器，美国Molecular Device公司。

1.2 全细胞膜片钳技术测定大鼠心室肌细胞IK1电流

Langendorff-原酶法分离大鼠心室肌细胞［7］。选取横纹清晰的心肌细胞进行实验。形成高阻抗封接后，负压破膜，进行全细胞记录。离子电流信号经Axopatch 200B膜片钳放大器、Digidate 1322A模数转换器及Pclamp8.0采集、贮存及分析。所有实验均在室温25℃下进行。

由于大鼠左心室IK1通道以Kir2.1亚单位为主［8］，重点观察激动剂对Kir2.1通道电流的影响。采用斜坡（ramp）方式钳制细胞由-40 mV去极化至60 mV，然后再以20 mV·s-1的速度连续复极化和超极化至-140 mV，以电压为横坐标，电流为纵坐标显示Kir2.1电流-电压（I-V）关系曲线。

1.3 在HEK293细胞建立大鼠心肌Kir2.1通道基因表达系统

将大鼠心肌Kir2.1基因插入pEGFP-N1质粒。重组质粒经Lipofectamine 2000试剂盒转染入人胚胎肾293（human embryonic kidney，HEK-293）细胞。在含15%胎牛血清的高糖DMEM培养基中，放置于37℃，5%CO2的细胞培养箱中孵育。应用全细胞膜片钳技术记录Kir2.1通道电流，观察扎考必利和莫沙必利对异源表达Kir2.1通道电流的影响。

1.4 Western蛋白印迹法检测大鼠心室肌细胞IK1Kir2.1蛋白表达

取4只健康成年SD大鼠，胶原酶法分离左心室肌细胞。大鼠左心室IK1通道以Kir2.1亚单位表达为主。将细胞梯度复钙（Ca2+终浓度1.8 mmol·L-1）后分别放入5个10 mL EP管中，调整细胞悬液体积为每管5 mL。将细胞随机分为5组，即正常对照组、莫沙必利1 μmol·L-1组、西沙必利1 μmol·L-1组、BZTZ 1 μmol·L-1组和扎考必利1 μmol·L-1组。室温孵育24 h后离心（600×g，5 min），弃上清，PBS冲洗2次后，-80℃冰箱冻存备用。总蛋白质提取后经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转移至NC膜上，室温下用5%脱脂奶粉封闭2 h，分别加入稀释后的Kir2.1一抗（1∶1000）4℃过夜孵育，洗膜后以辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶2000）室温下孵育1 h。化学发光法显影，Bio-R ad曝光采集信息备用。Image J软件对蛋白印迹进行积分吸光度（integrated absorbance，IA）分析。目标蛋白相对表达水平用IA目标蛋白/IAGAPDH比值表示。

1.5 离体大鼠心脏心电图记录

大鼠经戊巴比妥钠65 mg·kg-1麻醉。麻醉后颈动脉放血，迅速开胸取出心脏，通过主动脉悬挂于Langendorff装置上，恒温37℃，100%氧气饱和的台氏液以7 kPa恒压逆行灌流。将2根银丝分别置于心尖部与右心房的心外膜下同步记录心电图（ECG）。平衡1 h待各项指标稳定后，分别给予1 μmol·L-1的西沙必利、扎考必利、莫沙必利、BZTZ或扎考必利+西沙必利和扎考必利+BZTZ灌流心脏，持续30 min，记录给药后30 min内的室性期前收缩（premature ventricular beats，PVB）数目，室速（ventricular tachycardia，VT）和室颤（ventricular fibrillation，VF）发生率。心律失常类型：PVB，连续出现5个以下的室性异位搏动；VT，连续出现5个以上的室性早搏；VF，QRS波及T波消失，代之以一系列大小、形状不同的不规则波动。剔除自发心律失常的样本。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 4种5-HT4受体激动剂对心肌细胞膜IK1电流的影响

BZTZ、西沙必利和莫沙必利0.1～10 μmol·L-1可浓度依赖性抑制心肌IK1；在相同浓度时，BZTZ对IK1的抑制最明显（图2和3）。BZTZ、西沙必利和莫沙必利1 μmol·L-1使IK1内向电流密度（命令电压为-100 mV）由给药前的（-8.05±1.02）pA·pF-1分别下降至（-5.88±1.21）pA·pF-1（P＜0.01），（-7.21± 0.33）pA·pF-1（P＜0.05）和（-7.41±1.37）pA·pF-1，使IK1外向电流密度（命令电压为-60 mV）由给药前的（2.82±0.10）pA·pF-1分别下降至（2.06±0.16）pA·pF-1（P＜0.01），（2.43±0.09）pA·pF-1（P＜0.01）和（2.56± 0.10）pA·pF-1（P＜0.01）。而在0.1～10 μmol·L-1范围内，扎考必利可增强IK1。1 μmol·L-1为其最大效应浓度，使IK1内向电流密度（命令电压为-100 mV）增强至（-11.38±1.21）pA·pF-1（P＜0.01），外向电流密度（命令电压为-60 mV）增强至（3.73±0.17）pA·pF-1（P＜0.01）。

Fig.2 Effect of four 5-hydroxytryptamine type 4(5-HT4) receptor agonists on inward rectifier potassium current（IK1）in rat ventricular myocytes by whole-cell configration of patch-clamp technique.The dosage of the four agonists was 1 μmol·L-1，respectively.x±s，n=8 cells.

2.2 5-HT4受体激动剂对Kir2.1通道电流的影响

课题组前期工作表明，扎考必利可增强Kir2.1电流，但有效浓度＞30 μmol·L-1［8］。大鼠左心室IK1通道以Kir2.1亚单位为主。图4结果 显示，扎考必利30 μmol·L-1可使Kir2.1通道电流（-60 mV）由（1.06±0.10）pA·pF-1增大至（1.25±0.07）pA·pF-1（P＜0.01），而莫沙必利10 μmol·L-1对Kir2.1通道电流无明显影响。

Fig.3 Effect of different concentrations of four 5-HT4receptor agonists onIK1in rat ventricular myocytes by whole-cell configration of patch-clamp technique.x±s，n=8 cells.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control respectively.

Fig.4 Effect of mosapride and zacopride on Kir2.1 in HEK293 cells by whole-cell configration of patchclamp technique.The concentration was 10 μmol·L-1for mosapride and 30 μmol·L-1for zacopride.x±s，n=8.＊＊P＜0.01 compared with control.

2.3 4种5-HT4受体激动剂对大鼠心室肌细胞Kir2.1蛋白表达的影响

Western蛋白印迹结果 （图5）显示，扎考必利可上调大鼠心室肌细胞Kir2.1蛋白表达，西沙必利和BZTZ明显下调Kir2.1蛋白（P＜0.05），而莫沙必利对Kir2.1通道蛋白表达无明显影响。

Fig.5 Effect of four 5-HT4receptor agonists on Kir2.1 expression in rat left ventricular myocytes by Western blotting.The concentration of agents was 1 μmol·L-1respectively.x±s，n=4.＊P＜0.05，compared with control group.

2.4 4种5-HT4受体激动剂对大鼠离体心脏心律的影响

4种5-HT4受体激动剂对大鼠离体心脏节律的影响（表1，图6）。其中，BZTZ可引起明显的心律失常，在30 min内PVB数达到（159±28）个，8例离体心脏中4例出现VT，3例发展为VF。其次是西沙必利，PVB数（61±13）个，2例出现VT，1例发展为VF。莫沙必利和扎考必利对大鼠离体心脏的节律均无明显影响，不引起心律失常的发生。值得注意的是，当扎考必利分别与西沙必利和BZTZ联合灌流心脏时，可以抑制西沙必利和BZTZ诱发的PVB。

Tab.1Effect of 5-HT4receptor agonists on heart rhythm inex vivorat hearts

Fig.6 Effect of four 5-HT4receptor agonists at 1 μ mol·L-1respectively on ECGS inex vivorat hearts.Representative electrocardiogram tracings（recorded fromⅡlimb leads with recorder speed 100 mm·s-1）before and after application.A：control；B：cisapride；C：zacopride；D：BZTZ；E：mosapride. See Tab.1 for the treatment.

3 讨论

IK1通道广泛存在于心脏特别是心室肌细胞，参与静息膜电位的维持和心肌动作电位3期终末的复极［9-10］。在心室肌静息膜电位附近，IK1电导要远远大于除ATP敏感钾通道（IKATP）以外的其他离子通道，而IKATP在正常情况下是不激活的。因此，调节IK1必然影响心肌的兴奋性和心律失常的发生。从理论上讲，IK1下调将使膜去极化，细胞的兴奋性和自律性增高，易化延迟后除极等触发活动的发生［9］；IK1的抑制使膜电阻增大，放大了跨膜电流引起的膜电位波动，造成膜电位的不稳定；抑制IK1还可延长动作电位时程，引发长QT综合征。临床和实验研究也证明了阻断IK1的致心律失常风险。氯喹是一种广泛使用的抗疟药，它的安全剂量范围很窄，在有效治疗浓度可引起QRS和QT时间延长，稍大浓度即可引发室性异位节律和致命性心律失常。有研究表明这些副作用主要是其对IK1通道的抑制引起的［11-12］。Andersen-Tawil综合征是形成IK1的Kir2.1通道基因KCNJ2突变所致，突变基因通过负显性抑制效应使通道功能降低，多数患者出现QT延长伴有室性心律失常［13］；突变的Kir2.1通道基因转染给在体成年豚鼠心肌细胞，可导致IK1减小，动作电位时程延长，静息电位减小并不稳定和明显的异常自律性［14］。IK1减弱还是心衰时心律失常发生的重要机制［9，15］。心肌缺血和心肌梗死时发生的心律失常也与IK1的下降有关［16-17］。本研究发现，4种5-HT4受体激动剂可通过改变心肌IK1的功能或表达而影响大鼠的心律。西沙必利和BZTZ明显抑制或下调IK1通道，表现出高促心律失常风险；莫沙必利作为目前临床使用的促胃肠动力药，仅轻度抑制心肌IK1但不影响IK1表达，无促心律失常风险；同属5-HT4受体激动剂的扎考必利与前三者分子结构相似，但选择性激动大鼠心肌IK1，无促心律失常风险。提示对大鼠心室肌IK1抑制效应越强的药物其致心律失常风险越高，对IK1表达无明显影响或适度增强IK1的药物无致心律失常风险甚至具有抗心律失常效应。本研究中，扎考必利作为IK1特异性激动剂可以抑制西沙必利和BZTZ诱发的心律失常，表明适度激动IK1具有抗心律失常效应。理论上讲，激动IK1可增大静息膜电位（超极化），增加复极储备，缩短动作电位时程，有利于消除异常自律性和延迟后除极等触发活动。对于那些与IK1降低相关的心律失常，激动IK1很可能是有效的抗心律失常策略。4种药物的促心律失常风险等级依次为BZTZ＞西沙必利＞莫沙必利和扎考必利。Zhang等［8］的研究还发现，扎考必利对大鼠心肌IK1的激动效应不依赖于5-HT3和5-HT4受体，这可能是西沙必利、莫沙必利、BZTZ和扎考必利具有相似的化学结构和5-HT受体效应但是对IK1作用不同的原因。此外，也不能排除药物对其他心肌细胞膜离子通道或受体的作用，仅通过单一通道的影响来评估药物致心律失常和抗心律失常效应是具有局限性的。如在大鼠，西沙必利除了抑制IK外，还对ICa-L、INa、Ito有抑制作用，BZTZ亦可抑制Ito。但是鉴于抑制或下调IK1的促心律失常风险，并结合本研究结果 ，推测IK1可以作为筛选5-HT4受体激动剂是否具有促心律失常作用的独立风险因子。以IK1为靶点，可以从发病机制的角度，为筛选安全的5-HT4受体激动剂和促胃肠动力药提供一种更高效、便捷的方法。

［1］Sager PT，Gintant G，Turner JR，Pettit S，Stockbridge N.Rechanneling the cardiac proarrhythmia safety paradigm：a meeting report from the Cardiac Safety Research Consortium［J］.Am Heart J，2014，167（3）：292-300.

［2］Farre C，Fertig N.HTS techniques for patch clampbased ion channel screening-advances and economy［J］.Expert Opin Drug Discov，2012，7（6）：515-524.

［3］Li XW，Zheng SB.Current indication of safety of prokinetic agents［J］.Chin J New Drugs Clin Rem（中国新药与临床杂志），2015，34（9）：657-661.

［4］Layton D，Key C，Shakir SA.Prolongation of the QT interval and cardiac arrhythmias associated with cisapride：limitations of the pharmacoepidemiological studies conducted and proposals for the future［J］.Pharmacoepidemiol Drug Saf，2003，12（1）：31-40.

［5］Al-Judaibi B，Chande N，Gregor J.Safety and efficacy of tegaserod therapy in patients with irritable bowel syndrome or chronic constipation［J］.Can J Clin Pharmacol，2010，17（1）：e194-e200.

［6］Potet F，Bouyssou T，Escande D，Baró I.Gastrointestinal prokinetic drugs have different affinity for the human cardiac human ether-à-gogo K（+）channel［J］.J Pharmacol Exp Ther，2001，299（3）：1007-1012.

［7］Liu QH，Li XL，Xu YW，Lin YY，Cao JM，Wu BW. A novel discovery of IK1channel agonist：zacopride selectively enhances IK1current and suppresses triggered arrhythmias in the rat［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2012，59（1）：37-48.

［8］Zhang L，Liu Q，Liu C，Zhai X，Feng Q，Xu R，et al.Zacopride selectively activates the Kir2.1 channel via a PKA signaling pathway in rat cardiomyocytes［J］.Sci China Life Sci，2013，56（9）：788-796.

［9］Lopatin AN，Anumonwo JM.Structural and Molecular Bases of Cardiac Inward Rectifier Potassium Channel Function［M］//Zipes DP，Jalife J.Cardiac electrophysiology：from cell to bedside.6th ed. Philadelphia：WB.Saunders Co.2014：33-41.

［10］Janse MJ.Electrophysiological changes in heart failure and their relationship to arrhythmogenesis［J］.Cardiovasc Res，2004，61（2）：208-217.

［11］Rodríguez-Menchaca AA，Navarro-Polanco RA，Ferrer-Villada T，Rupp J，Sachse FB，Tristani-Firouzi M，et al.The molecular basis of chloroquine block of the inward rectifier Kir2.1 channel［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105（4）：1364-1368.

［12］Sánchez-Chapula JA，Salinas-Stefanon E，Torres-Jácome J，Benavides-Haro DE，Navarro-Polanco RA.Blockade of currents by the antimalarial drug chloroquine in feline ventricular myocytes［J］. J Pharmacol Exp Ther，2001，297（1）：437-445.

［13］Barajas-Martinez H，Hu D，Ontiveros G，Caceres G，Desai M，Burashnikov E，et al.Biophysical and molecular characterization of a novel de novo KCNJ2 mutation associated with Andersen-Tawil syndrome and catecholaminergic polymorphic ventriculartachycardia mimicry［J］.Circ Cardiovasc Genet，2011，4（1）：51-57.

［14］Miake J，Marbán E，Nuss HB.Functional role of inward rectifier current in heart probed by Kir2.1 overexpression and dominant-negative suppression［J］.J Clin Invest，2003，111（10）：1529-1536.

［15］Shah M，Akar FG，Tomaselli GF.Molecular basis of arrhythmias［J］.Circulation，2005，112（16）：2517-2529.

［16］Aimond F，Alvarez JL，Rauzier JM，Lorente P，Vassort G.Ionic basis of ventricular arrhythmias in remodeled rat heart during long-term myocardial infarction［J］.Cardiovasc Res，1999，42（2）：402-415.

［17］Pinto JM，Boyden PA.Reduced inward rectifying and increased E-4031-sensitive K+current density in arrhythmogenic subendocardial purkinje myocytes from the infarcted heart［J］.J Cardiovasc Electrophysiol，1998，9（3）：299-311.

Effect of four 5-hydroxytryptamine type 4 receptor agonists on rat cardiac IK1channels and proarrhythmic risk stratification

LIU Qing-hua1＊,LI Yu2＊,CAO Xiao-na2,ZHANG Li3,ZHAI Xu-wen1
(1.Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China;2.Beijing Sports University Hospital, Beijing 100084,China;3.Shanxi Provincial Children′s Hospital,Taiyuan 030013,China)

OBJECTlVETo compare the effect of four 5-hydroxytryptamine type 4(5-HT4)receptor agonists:cisapride,zacopride,macopride and 2-[1-(4-piperonyl)piperazinyl]-benzothiazole(BZTZ),on rat cardiac inward rectifier potassium channel(IK1)and heart rhythm.METHODSThe whole-cell configuration of patch-clamp technique was used to record effects of 5-HT4receptor agonists on IK1in enzymatic dissociated rat ventricular myocytes or Kir2.1 transfected HEK 293 cells.Western blotting was used to observe the expression of Kir2.1 channel exposed 24 h to agents in ventricular myocytes.Langendorff-perfused hearts were perfused with four agents respectively for 30 min.The electrocardiogram was recorded simultaneously.RESULTSBZTZ,cisapride and mosapride 0.1-10 μmol·L-1decreased IK1in a concentrationdependent manner.At the same concentration(1 μmol·L-1),BZTZ showed the most potent inhibition on IK1(P＜0.01),followed by cisapride.Mosapride showed slight inhibition efficiency.However,zacopride enhanced IK1(P＜0.01).In Kir2.1 heterologous expression systems,zacopride activated Kir2.1 current (P＜0.01)while mosapride had no effect.In ex vivo Langendorff-perfused hearts,BZTZ and cisapride 1 μmol·L-1elicited singnificant rhythm disturbances,and the total of premature ventricular beats(PVB)were 159±28 and 61±13.50%(4/8)(P＜0.05)and 25%(1/8)of the hearts exhibited ventricular tachycardia(VT), while 37.5%(3/8)and 12.5%(1/8)of the hearts exhibited ventricular fibrillation(VF),respectively.Mosapride and zacopride had no side effects on heart rhythm.Zacopride also suppressed BZTZ-or cisapride-induced arrhythmias.BZTZ had the strongest proarryhthmic potency among the 5-HT4agonists,followed by cisapride, mosapride and zacopride.CONCLUSlONIK1might be an independent risk factor for arrhythmogenesis and a new target for screening safe 5-HT4receptor agonists and gastrointestinal prokinetic agents.

inward rectifier K+channel;arrhythmia;5-hydroxytryptamine type 4 receptors;gastrointestinal prokinetic agent

The project supported by National Natural Science Foundation of China(31200864);and Research Project Supported by Shanxi Scholarship Council of China(2016-059)

LIU Qing-hua,E-mail:liuqh20041206@163.com,Tel:13753119195

R966,R972+.2

A

1000-3002-（2017）06-0534-07

2016-10-12接受日期：2017-05-02）

（本文编辑：贺云霞）

国家自然科学基金（31200864）；山西省回国留学人员科研资助项目（2016-059）

刘清华，女，副教授，主要从事心血管生理和药理学研究；李瑜，女，本科，主治医师，主要从事心血管临床及生理和药理学研究。

刘清华，E-mail：liuqh20041206@163.com，Tel：13753119195

＊共同第一作者。

＊Co-first author.