HOTAIR通过E-cadherin对胶质瘤侵袭和转移的影响研究

李锡清 赵尊兰 刘冬玲 刘明月 马 宁 李 明 周 云△

1)河南省人民医院肿瘤科，河南 郑州 450003 2)河南省人民医院全科医学科，河南 郑州 450003 3)美国加州大学圣地亚哥分校药学院 4)河南省人民医院神经外科，河南 郑州 450003

·论著 科研之窗·

HOTAIR通过E-cadherin对胶质瘤侵袭和转移的影响研究

李锡清1)赵尊兰2)刘冬玲3)刘明月1)马 宁1)李 明4)周 云1)△

1)河南省人民医院肿瘤科，河南 郑州 450003 2)河南省人民医院全科医学科，河南 郑州 450003 3)美国加州大学圣地亚哥分校药学院 4)河南省人民医院神经外科，河南 郑州 450003

目的 观察HOTAIR对胶质瘤细胞侵袭和转移能力的影响。方法 使用q-PCR从临床标本中检测HOTAIR与E-cadherin的关系，体外常规培养SWO-38和U251细胞，过表达HOTAIR后使用划痕实验检测细胞侵袭、迁移能力；Western blotting检测细胞中E-cadherin蛋白的表达。结果 q-PCR胶质瘤组织中HOTAIR高表达组中E-cadherin表达的均值较低，较HOTAIR低表达组低，差异有统计学意义(P<0.05)；在SWO-38和U251细胞中过表达HOTAIR后Western blotting检测发现E-cadherin表达减少，划痕实验显示过表达HOTAIR后细胞迁移能力增强。结论 HOTAIR可增加胶质瘤的侵袭和转移，可能与其降低E-cadherin蛋白的表达有关。

胶质瘤；HOTAIR；E-cadherin侵袭

胶质瘤在神经系统中是恶性程度最高的肿瘤，尽管胶质瘤能从手术和化放疗中获益，但中位生存期约12个月，大部分病人治疗后再次复发[1]。为获得更好的治疗效果，需从胶质瘤的分子生物学机制进行研究[2]。长链非编码RNA通过对mRNA的影响，对胶质瘤的生长和转移产生影响，我们的前期研究表明，HOTAIR对肠癌和肺癌的治疗效果及预后产生影响[3-4]。也有报道显示，HOTAIR在胶质瘤中发生发展中发挥作用。E-cadherin通过对EMT的影响，作为肿瘤侵袭和转移的关键基因在很多肿瘤中发挥作用[5]，我们的前期工作在鼻咽癌中也证实E-cadherin和侵袭和转移相关；也有研究表明，E-cadherin在胶质瘤中发挥抑癌作用[6]。但目前HOTAIR和E-cadherin在胶质瘤中的表达关系尚无研究报道。本研究拟从HOTAIR和E-cadherin在胶质瘤中的表达关系进行研究，分析其在胶质瘤中可能的作用机制。

1 材料与方法

1．1 实验材料 临床资料和试剂：选取2011-09—2013-09在我院经病理学切片检查确诊为胶质瘤并实施手术治疗的患者60例，年龄(55±17)岁。取患者的肿瘤组织及癌旁边缘正常组织，标本离体后30 min内转移到液氮保存备用。SWO-38和U251细胞购自上海拜力生物科技有限公司。E-cadherin抗体购自美国Santa Cruze公司。RNA提取及实时荧光定量PCR所用试剂购自美国Invitrogen公司，RNAs引物由上海生工合成，PCR试剂盒购自日本Takara公司。Western blotting试剂购自广州康为生物科技有限公司。HOTAIR模拟物和抑制剂由上海吉玛公司合成。将HOTAIR扩增后克隆进入过表达载体pCDH-MSCV-mcs-EF1-GFP-T2A-Pu(SBI)，并包装成为慢病毒感染细胞，表达和对照质粒均来自ADDGENE(美国)，包装质粒psPAX2和pMD2.G由 Didier Trono教授赠送(University of Geneva，Geneva，瑞士)。1．2 q-PCR检测HOTAIR和E-cadherin在胶质瘤中的表达 实时荧光定量PCR检测胶质瘤组织中HOTAIR和E-cadherin的表达，引物见表1，依据Trizol说明书提取贴壁细胞的总RNA。实时荧光定量PCR：采用茎环法进行miRNAs逆转录，20 μL体系：8 μL ddH2O、1 μL RNA模板、RNAs茎环逆转录特异性引物和内参U6逆转引物各1 μL混匀，65 ℃ 5 min，按PCR说明书加样后上机检测。miRNAs的表达量以U6为内参，用2-△△Ct计算，△△CtmiRNAs=(CtRNAs-CtU6)处理组-(CtRNAs-CtU6)对照组。

表1 qPCR所用的引物

1．3 划痕实验检测HOTAIR对胶质瘤细胞侵袭能力的影响 在胶质瘤SWO-38和U251细胞中过表达HOTAIR，取1×106个细胞接种于12孔板中过夜贴壁，划痕，换培养基，继续培养24 h，显微镜下观察细胞的体外迁移、侵袭能力。

1．4 Western blotting检测HOTAIR对胶质瘤细胞中E-cadherin蛋白表达的影响 在胶质瘤SWO-38和U251细胞中过表达HOTAIR后，收集蛋白，上样，恒压90 V电泳30 min后110 V电泳60 min。转膜后用5% BSA室温封闭1 h。一抗按1：500比例稀释，4 ℃下孵育18 h以上，TBST洗膜3次，10 min/次。二抗按1：2 000稀释室温孵育2 h，检测相应蛋白的表达量。

2 结果

2．1 HOTAIR在胶质瘤组织中表达高于相应癌旁手术边缘正常组织 RT-qPCR定量结果显示，HOTAIR在胶质瘤患者癌组织标本的Ct值明显低于相应癌旁正常组织，表明HOTAIR在胶质瘤组织中表达上调。60例患者癌组织中HOTAIR的相对表达量高于癌旁正常组织，差异有统计学意义(P<0.05，图1)，对应的检测E-cadherin在胶质瘤及癌旁正常组织中的表达发现，正常组织中的E-cadherin表达明显高于癌组织，差异有统计学意义(P<0.05，图2)。

2．2 胶质瘤组织中HOTAIR表达水平与E-cadherin表达之间的关系 HOTAIR的中位值作为分界点，把胶质瘤组织中HOTAIR的表达分为高表达组和低表达组，对比2组的E-cadherin表达发现，HOTAIR高表达组中E-cadherin的表达量相对较低，差异有统计学意义(P<0.05，图3)。

图1 HOTAIR在胶质瘤中的表达量高于癌旁正常组织

图2 E-cadherin在胶质瘤中的表达量低于癌旁正常组织

图3 胶质瘤组织中HOTAIR高表达组E-cadherin表达相对量低于低表达组

2．3 过表达HOTAIR可引起胶质瘤细胞的侵袭能力增强 将过表达HOTAIR的SWO-38和U251细胞及其对照细胞传代到TRANSWELL，培养基进行培养24、48和72 h，将TRANSWELL膜取下，进行染色，显微镜下观察细胞侵袭并穿透TRANSWELL膜的数量，可明显看出HOTAIR引起胶质瘤细胞侵袭的细胞数量增加(表2)。

表2 胶质瘤细胞侵袭TRANSWELL膜的数量

2．4 HOTAIR过表达后可引起E-cadherin表达降低 过表达HOTAIR的SWO-38和U251细胞及其对照细胞进行培养，Western blot检测发现胶质瘤细胞中过表达HOTAIR后Ecadherin表达水平明显下降(图4)。

SWO-38 U251

注：Cont为对照组，GAPDH为内参图4 过表达HOTAIR后Ecadherin表达水平发生改变

3 讨论

HOTAIR是关注度最高的LncRNAs。一般认为，LncRNAs为类似mRNA的长链非编码RNA，一般长度大于200 bp。运用目前的测序方法表明人体内有20 000个LncRNAs[7]，LncRNAs可预测治疗效果和病人预后。HOTAIR的研究表明主要发挥癌基因的作用，并对肿瘤的侵袭和转移发生作用，目前的热点在于发现和阐明其靶基因的作用[8]。

我们的研究表明，胶质瘤组织中的HOTAIR表达根据中位值分为高表达组和低表达组，高表达组中E-cadherin低表达，体外实验同样表明，过表达HOTAIR后胶质瘤细胞中的E-cadherin低表达，说明HOTAIR和E-cadherin之间存在关系，这可能是HOTAIR影响胶质瘤转移的作用靶点。

既往研究表明，HOTAIR通过对PDCD4的影响来对胶质瘤的侵袭和转移产生作用；同时，也有研究表明，PDCD4和E-cadherin之间存在相互调节的关系[9]，且E-cadherin和侵袭、转移的关系更密切。因此，我们的研究证实了HOTAIR可通过对E-cadherin的作用发挥抗胶质瘤转移的作用。

目前，在HOTAIR的靶基因研究中，靶基因的确定和miRNA相似，主要通过确定结合位点，但长链非编码RNA的靶点确定较miRNA的互补结合更复杂[10]。虽本研究中明确HOTAIR和E-cadherin之间存在关系，但还不能证实两者存在直接的调节关系，需后续研究进一步证实。

[1] Chen Y，Bian Y，Zhao S，et al．Suppression of PDCD4 mediated by the long non-coding RNA HOTAIR inhibits the proliferation and invasion of glioma cells[J]．Oncol Lett，2016，12(6)：5 170-5 176．

[2] Kiang KM，Zhang XQ，Leung GK．Long Non-Coding RNAs：The Key Players in Glioma Pathogenesis[J]．Cancers (Basel)，2015，7(3)：1 406-1 424．

[3] Liu MY，Li XQ，Gao TH，et al．Elevated HOTAIR expression associated with cisplatin resistance in non-small cell lung cancer patients[J]．J Thorac Dis，2016，8(11)：3 314-3 322．

[4] Luo ZF，Zhao D，Li XQ，et al．Clinical significance of HOTAIR expression in colon cancer[J]．World J Gastroenterol，2016，22(22)：5 254-5 259．

[5] Pantazi E，Gemenetzidis E，Teh MT，et al．GLI2 Is a Regulator of beta-Catenin and Is Associated with Loss of E-Cadherin，Cell Invasiveness，and Long-Term Epidermal Regeneration[J]．J Invest Dermatol，2017 Mar 11．[Epub ahead of print]

[6] Iwadate Y．Epithelial-mesenchymal transition in glioblastoma progression[J]．Oncol Lett，2016，11(3)：1 615-1 620．

[7] Zhang R，Xia LQ，Lu WW，et al．LncRNAs and cancer[J]．Oncol Lett，2016，12(2)：1 233-1 239．

[8] Weidle UH，Birzele F，Kollmorgen G，et al．Long Non-coding RNAs and their Role in Metastasis[J]．Cancer Genomics Proteomics，2017，14(3)：143-160．

[9] Wang Q，Sun ZX，Allgayer H，et al．Downregulation of E-cadherin is an essential event in activating beta-catenin/Tcf-dependent transcription and expression of its target genes in Pdcd4 knockdown cells[J]．Oncogene，2010，29(1)：128-138．

[10] Botti G，Marra L，Malzone MG，et al．LncRNA HOTAIR as Prognostic Circulating Marker and Potential Therapeutic Target in Patients with Tumor Diseases[J]．Curr Drug Targets，2017，18(1)：27-34．

(收稿 2017-03-03)

责任编辑：夏保军

Study of HOTAIR effect invasion and metastasis of glioma by E-cadherin

LiXiqing﹡，ZhaoZunlan，LiuDongling，LiuMingyue，MaNing，LiMing，ZhouYun

﹡DepartmentofOncology，thePeople’sHospitalofHenanProvince，Zhengzhou450003，ChinaCorrespondingauthor：ZhouYun，Email：zlk092@126.com

Objective To observe the effect of HOTAIR on invasion and metastasis of glioma．Methods Using q-PCR to test the relationship between HOTAIR and E-cadherin from clinical specimens．The invasion and metastasis of cells were tested through Wound Healing after HOTAIR overexperssion in the conventional culture SWO-38 and U251 cells in vitro．Western blotting was used to test the expression of C-cadherin protein in cells．Results In q-PCR glioma tissue，the expression average of E-cadherin was lower in HOTAIR high expression than that in HOTAIR low expression．The difference was statistically significant．After overexpression HOTAIR in SWO-38 and U251 cells，the expression E-cadherin was decreased through Western blotting detection．Wound Healing showed that the ability of metastasis was enhanced after HOTAIR overexpression．Conclusion HOTAIR can increase the invasion and metastasis of glioma，which may be related to the decreased E-cadherin expression．

Glioma；HOTAIR；E-cadherin invasion

国家自然科学基金(U1504820)

R730.264

A

1673-5110(2017)13-0001-04

△通信作者：周云，主任医师，教授，河南省人民医院肿瘤科主任，研究方向：恶性肿瘤的化疗及综合治疗。Email：zlk092@126.com