灭菌豆干货架期内品质变化及微生物群落多样性分析

李志波，刘特元，钱植龙，杨忠明，刘忠祥，梁天姣

（湖南省华文食品有限公司，湖南岳阳414000）

灭菌豆干货架期内品质变化及微生物群落多样性分析

李志波，刘特元，钱植龙，杨忠明，刘忠祥，梁天姣

（湖南省华文食品有限公司，湖南岳阳414000）

取车间生产的灭菌前的预包装香辣味豆干为材料，在实验室进行105℃、40 min的热处理，研究其常温保存条件下货架期30 d后的品质变化及微生物状况。结果表明，实验样品在贮藏30 d后生长了大量细菌和真菌，其菌落总数达到了6×105CFU/g，微生物含量严重超标，且产生的代谢物导致样品酸味突出，口感变糙。高通量测序及分析显示，实验样本中芽孢杆菌属（Bacillus）微生物占比细菌含量为80.69%，为绝对优势细菌，酵母菌（Saccharomycetes）为主要优势真菌，占比真菌含量为32.99%。而进一步的研究发现，热噬淀粉芽孢杆菌（Bacillus thermoamylovorans）和德式乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）是本实验中主要的腐败细菌。

豆干；品质；微生物群落；食品安全性

两千多年来，豆制品以其独特的风味、嫩滑的口感、丰富的营养价值和食疗价值备受人们的青睐，是中华传统美食文化中不可或缺的一部分。近些年，我国豆制品市场容量持续扩大，促进着豆制品行业的不断发展[1]。然而豆制品这种丰富的营养体，在生产卫生条件控制不好或终产品灭菌条件达不到要求等的情况下，货架期内很容易发展成为适合多种类群微生物生长、繁殖的天然培养基。当这些微生物类群在豆制品中的数量或代谢产物累积到一定程度时，便可能引起食品的腐败变质或食源性疾病。食品安全问题关系到企业的发展和消费者的健康，有关豆制品会带来的致病菌生长及其产毒素能力有资料曾做过评估[2-3]，国外曾报导过豆制品滋生志贺氏菌（Shigella sonnei）和耶尔森菌（Yersinia enterocolitica）引起食品中毒事件[4-5]，国内彭玲慧等[6-7]也从豆制品中分离到致病菌蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）。在如今我国豆制品市场消费量增长迅速而豆制品行业发展相对滞后的情况下，加强豆制品开发的基础研究并改良生产工艺，对于提高豆制品的生产效能和食品安全性十分重要。

豆制品生产流程比较繁琐，需要控制的关键点很多，各道工序之间关系复杂，但它们共同作用的结果最终都会表现在产品的品质和食品安全性上。杀菌是成品外包装前的最后一道重要工序，其不同的操作条件之于产品的物性和食品的安全性会存在一定的“拮抗”效果[8]。其具体内容为：在杀菌时间相差不是很大的情况下，灭菌温度高（115～121℃）时会提高食品安全性但不利于产品的物性，灭菌温度低（98～105℃）时产品物性更好但不利于食品安全性。鉴于此，本实验以相对低温105℃（40 min）对包装后豆干进行杀菌处理，贮藏一个月后检测产品品质的变化和微生物群落多样性，再以此为基础结合生产环境、灭菌技术等来分析和探讨怎样较好地平衡豆制品产品品质与食品安全性之间的关系，以期为豆干及其他豆制品的安全生产和品质保证提供相关理论数据和合理建议。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

豆干样品采自湖南省华文食品有限公司（25 g预包装产品），MC培养基、MRS培养基：广东环凯微生物科技有限公司；平板计数琼脂（plate count agar）培养基：上海盛思生化科技有限公司。

1.2 仪器与设备

YX-350Z型高压蒸汽灭菌锅：上海三申医疗器械有限公司；DH5000Ⅱ型恒温培养箱：天津市泰斯特仪器有限公司；KDN智能型凯式定氮仪：上海精隆科学仪器有限公司；202-1型电热恒温干燥箱：北京科伟永兴一起有限公司；S8-Biotech Kit型pH计：梅特勒-托利多公司。

1.3 方法

取湖南省华文食品有限公司生产的25 g香辣味预包装（真空）卤制豆腐干为实验样品，经105℃灭菌40 min后室内常温放置30 d，低温（2～8℃）保存备用。

取一部分混合均匀样品检测各理化指标，水分、蛋白质、脂肪、碳水化合物、钠、微生物菌落总数分别参照国标GB 5009.3—2010《食品中水分的测定》、GB5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》、GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的测定》、GB10769—2010《婴幼儿谷类辅助食品》、GB/T23494—2009《豆腐干》、GB 4789.2—2010《菌落总数测定》检测。

另于无菌条件下取25 g混匀样品，剪碎，置于225 mL无菌水（pH值为6.35）摇匀制成菌悬液，取适量涂布于MRS培养基，37℃培养36 h后观察菌落生长状况并进行划线分离纯化。再取一部分样品并同分离的优势菌送上海生工生物工程有限公司进行宏基因组微生物分类测序，其中细菌16S rDNA测序基因扩增区域为V3-V4区，真菌测序基因扩增区域为ITS1-ITS2区。

2 结果与分析

2.1 实验豆干的物性变化

由表1可知，经实验条件灭菌处理1 d后豆干外部呈黄色、内部乳白色，香味浓厚，具有较好的滑、软、弹性，味道正常，气孔较少，结构紧凑，切面光滑。而常温贮藏30 d后，豆干的颜色、气味、口感及内部质构都发生了较为明显的变化，其内部颜色较之前稍显变黄，豆干出现酸味，口感比较粗糙，并且内部质构孔隙增多，发硬成块状感，但未出现胀包情况。

表1 实验豆干贮藏1 d和30 d后的感官评价Table 1 Sensory evaluation of experimental dried bean curd after 1 d and 30 d storage

贮藏30 d内，豆干的主要理化指标及微生物指标检测结果见表2，其与初始豆干（贮藏0 d）的主要理化指标基本相同，但微生物菌总数明显增长，达到了6×105CFU/g。另外，贮藏30 d后豆干的pH检测值明显下降，比初始状态较低了约1.1（初始状态pH值为5.82左右）。这说明，实验灭菌条件不足以杀灭样品中所有的微生物体，而这类经105℃灭菌40 min仍存活的微生物体的菌相特征为：都具有良好的耐热性、具产酸能力的菌种、代谢途径都为同型发酵。

表2 实验豆干贮藏30 d内的主要理化指标及菌落总数Table 2 Main physical and chemical indicators and total bacterial count of experimental dried bean curd in 30 d storage

2.2 实验样本中细菌的多样性分析

2.2.1 细菌群落高通量测序分析

高通量测序过程中，测序序列数目达到79 603，其Simpson多样性指数为0.33，说明样本中有着较为丰富的细菌种类及数量。属水平样本的丰度饼图见图1。由图1可知，芽孢杆菌属（Bacillus）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、乳杆菌属（Lactobacillus）、乳球菌属（Lactobacillus）在测序过程中的reads数目＞1 000，为样本中的主要微生物类群，而芽孢杆菌属微生物优势十分突出，其含量达到了细菌总数的80.69%。由图2可知，样本中细菌集中在厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）和变形菌门（Proteobacteria），有着较高的遗传多样性。

图1 细菌属水平样本的丰度饼图Fig.1 Abundance pie chart of bacteria at genus level

图2 细菌分类和系统发育信息可视化图Fig.2 Visualization diagram of bacterial classification and phylogenetic information

一些学者研究认为豆腐的腐败与样品的物理性质及初始微生物状况密切相关。许多研究证明了此观点[9]，如FOUAD K E等[10]的研究表明，石膏豆腐在低温（2～3℃）贮存条件下贮存30 d后的主要腐败菌有乳酸菌（lactic acid bacteria）、肠道菌（enteric bacteria）及假单胞菌属（Pseudomonas）。TUITEMWONG K等[11]分离自7℃贮藏1 d和30 d后豆干中的微生物类群为链球菌属（Streptococcusspp.）、片球菌属（Pediococcussp.）、乳杆菌属（Lactobacillusspp.）、绿脓假单胞菌（Pseudomonas pyocyaneum）、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）、阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）及产气杆菌（Enterobacter agglomerans）。李除夕等[7]的研究结果显示，豆腐货架期内的主要腐败菌为稳杆菌属（Empedobacter）、库特氏菌属（Kurthia gibsonii）和芽孢杆菌属（Bacillus cereus）。邓勇等[12]的研究认为内酯豆腐中的腐败菌为凝结芽孢杆菌（Bacillus eoagulaus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），且其数量分别占总菌数的15%和75%。在本研究结果出现的4大微生物属中，类芽孢杆菌属（Paenibacillus）为特定存在的微生物类群，其他3类在以上研究中都有出现。

2.2.2 酸败优势细菌分析

本实验豆干贮藏期间残存的细菌能够适应真空包装环境，并利用豆干丰富的营养物质进行生长和繁殖。其中一些物种能够产生某些引起豆干物性改变的代谢产物，并最终导致豆干难以被接受，是该产品在本实验处理条件（105℃灭菌）下的特定腐败细菌。而本实验豆干最为明显的改变是样品内出现了酸性物质，且这些酸性物质又可能引起了豆干内部质构的变化。

取实验样品制成菌悬液并接种于MRS培养基上，于37℃培养36 h。结合菌落形态分析及生理生化试验，初步分离并纯化出两株优势微生物。而分子鉴定结果显示，这两株菌为热噬淀粉芽孢杆菌（Bacillus thermoamylovorans）和德式乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii），其菌体的革兰氏染色结果见图3。

图3 热噬淀粉芽孢杆菌(A)及德氏乳杆菌(B)革兰氏染色图(10×100）Fig.3 Gram stain ofBacillus thermoamylovorans(A)and Lactobacillus delbrueckii(B)

由图3可知，两株菌均为革兰氏阴性菌。本研究中，105℃灭菌豆干30d货架期内的酸败应当主要为热噬淀粉芽孢杆菌（Bacillus thermoamylovorans）和德式乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）共同作用的结果，它们属于本实验样品的特定腐败细菌，能够代谢碳水化合物产生有机酸[13-14]。

2.3 实验样本中真菌的多样性分析

实验样本中也存在一定数量和种类的真菌，其测序序列数目为22 166，Simpson多样性指数为0.12。属水平样本的丰度饼图见图4，可视化系统发育信息图见图5。

由图4可知，酵母菌（Saccharomycetes）为样本中真菌微生物的优势类别，其所占真菌比例为32.99%，占整个样品微生物群落的比例为7.19%。而测序过程中reads数目大于1000的还有假丝酵母属（Candida）、发菌科（Trichocomaceae）及一未分类类群，它们构成了实验样本的主要真菌类群。另外Incertae sedis、Khuskia、Monascaceae、Pseudozyma、Issatchenkia、Eurotiomycetes、Ceratobasidiaceae、Pleurotus、Sarocladium及Aspergillus类群真菌在样本中也有一定含量。

图4 真菌属水平样本的丰度饼图Fig.4 Abundance pie chart of fungi at Genus level

图5 真菌分类和系统发育信息可视化图Fig.5 Visualization diagram of fungi classification and phylogenetic information

由图5可知，样本中检测到的真菌归属于子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）和接合菌门（Zygomycota）。它们聚类范围分布广，亲缘关系较远，表明有许多类别的真菌或其孢子在105℃实验条件处理下能够保存下来，并在贮藏过程中得以生长和繁殖。

2.4 讨论

本实验中，低温（105℃）灭菌的实验样品贮存一个月后产生了明显的酸败现象，以热噬淀粉芽孢杆菌和德氏乳杆菌为主的耐热菌应当是引发酸败的主要微生物类群；而滋生的大量其他芽孢杆菌、类芽孢杆菌、酵母菌等微生物不仅引起样品微生物超标，还可能生长有致病微生物，并且对豆干的质构及口味产生破坏效果。采用115℃灭菌40 min条件下灭菌产品在相当时间的货架期内能保持无菌状态。为此损失了一部分的产品特性并提高了成本，但其风味和口感仍能达到要求。针对目前市场上非发酵豆制品菌落总数合格率较低的状况[15]，建议豆制品生产企业在能够满足品质要求的情况下，适当提高杀菌温度，以达到较好的食品微生物安全性。

豆制品工艺的复杂性使得生产过程中对微生物污染的控制难度也很大。豆腐从磨浆到烘烤前是微生物侵袭的主要阶段，而包括原料、水所载荷的和空气中浮游的微生物是主要的污染来源[16]，当这些微生物进入到豆浆和豆腐这类合适的基质时便能迅速生长和繁殖。尤其当采用生浆工艺、低温点浆（60℃左右），较长时间的蹲脑和压榨等这类工艺时，一些耐热并适应豆浆营养环境的微生物则能获得更好的生长条件和繁殖时间。对于持续生产的豆制品车间，若设备管道清洗不及时不到位而残留有豆浆等物料、产生的黄浆水和报废品清理不及时不完全，则在气温较高的季节很容易形成微生物发展的温床，继而引起车间环境和豆胚的严重生物污染。因此，注重对生产环境的清理和控制、采取好的车间杀菌措施等有利于保证好的豆胚品质，并能在一定程度上降低成品的杀菌要求，实现豆制品品质与杀菌条件的更好平衡。

超高压灭菌技术在豆制品生产中的运用条件和要求，对于获得更好物性的豆制品是一条很有空间的途径。另外，加强豆制品的制作、保藏等相关方面的的理论研究对于豆制品行业的健康发展也是十分必须的。检测不同环境条件、不同生产工艺、不同初始微生物和不同运输、贮藏状况下微生物污染的发展程度和方向，再以此为数据基础建立生产过程和货架期内微生物变化的预测模型，能够有效地从宏观上把控不同阶段微生物的微观变化情况。

3 结论

105℃灭菌豆干贮藏30 d后，微生物含量严重超标，其色、香、味及内部质构较初始状况都发生了一定变化，酸味突出，结构变糙。

实验样本中细菌的多样性丰富，芽孢杆菌属（Bacillus）微生物是主要类群（80.69%），而类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、乳杆菌属（Lactobacillus）、乳球菌属（Lactococcus）微生物的含量也较大，其占比分为3.70%、1.52%、1.37%。分离鉴定出的热噬淀粉芽孢杆菌（Bacillus thermoamylovorans）和德式乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）是本实验中主要的腐败细菌。

实验样本中存在一定数量和种类的真菌，酵母菌（Saccharomycetes）、假丝酵母属（Candida）、发菌科（Trichocomaceae）微生物是已分类出的主要类群，其含量分别为32.99%、5.57%、5.33%。

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Quality change and microbial community diversity analysis of sterilized dried bean curd in shelf life

LI Zhibo,LIU Teyuan,QIAN Zhilong,YANG Zhongming,LIU Zhongxiang,LIANG Tianjiao
(Hunan Huawen Food Co.,Ltd.,Yueyang 414000,China)

Using the prepackaged spicy dried bean curd before sterilization from workshop production as material,heat treatment was conducted at 105℃for 40 min,to study its physical properties change and the status of the microbes after 30 d shelf life in normal temperature.The results showed that the experimental sample germinated large number of bacteria and fungi after 30 d storage.The total count of bacteria was 6×105CFU/g, it severely exceeded the limit,and the metabolites leaded to obvious sour and rough taste.High throughput sequencing and analysis results showed thatBacilluswas the dominate bacteria in the experimental samples and the proportion was 80.69%.Saccharomyceteswas the dominant fungi and the proportion was 32.99%.Further studies found thatBacillus thermoamylovoransandLactobacillus delbrueckiiwas the main spoilage bacteria in the experiment.

dried bean curd;quality;microbial community;food safety

Q93-331

0254-5071（2017）07-0124-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.07.027

2016-12-20

李志波（1989-），男，工程师，硕士，研究方向为豆制品加工技术。