东北酸菜优良乳酸菌筛选及其抑菌特性研究

王磊，张洁，赵国忠*

（1.天津市食品安全检测技术研究院，天津300308；2.天津科技大学食品营养与安全教育部重点实验室，天津300457；3.江南大学食品学院，江苏无锡214122）

东北酸菜优良乳酸菌筛选及其抑菌特性研究

王磊1，张洁1，赵国忠2，3*

（1.天津市食品安全检测技术研究院，天津300308；2.天津科技大学食品营养与安全教育部重点实验室，天津300457；3.江南大学食品学院，江苏无锡214122）

该实验从东北酸菜中分离纯化并鉴定出40种乳酸菌，主要为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、融合魏斯氏菌（Weissella confuse）、副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、食窦魏斯氏菌（Weissella cibaria）。通过测定乳酸菌乳酸产量及其抑制大肠杆菌（Escherichia coli）的能力，探究乳酸菌的产酸量与其抑菌作用之间相互关系。结果表明，菌株C1、E8、A5产酸能力较强，发酵12 h后发酵上清液中乳酸质量浓度＞12 g/L，抑菌圈直径＞12 mm，对大肠杆菌抑制能力强。表明东北酸菜中乳酸菌的产酸量与抑菌作用存在紧密的联系。

东北酸菜；乳酸菌；筛选；产酸量；抑菌特性

酸菜是一种历史悠久且味道鲜美的发酵蔬菜食品。东北酸菜作为发酵蔬菜中最具特色的一种，对东北乃至全国都具有重要影响。东北酸菜采用东北当地生产的大白菜腌制而成，极具东北地方特色，色泽靓丽，柔软上口，吃起来酸爽可口，让人不忍释怀[1]。东北酸菜因其具有酸爽可口、鲜咸开胃、脆嫩解腻并能助消化等特点而深受东北人民喜爱，其不仅口味绝佳，而且具有驱寒、开胃、消食等功能。东北酸菜在我国已发展传承千年之久，但真正的发展还是在建国之后，特别是在最近十几年以来。酸菜的发展历程主要有三个阶段，分别为传统家庭坛装自酿发酵蔬菜、作坊式自然发酵酸菜、引进高新技术的新型冷链型酸菜[2]。酸菜的研究主要集中在发酵机理、菌种选育、化学成分、风味物质等方面。

目前，东北酸菜的发展仍然存在着各种各样的问题。其中，机械化程度高的企业对于酸菜品质的控制最为担忧。研究酸菜发酵微生物对于酸菜品质的提升具有一定的现实意义。乳酸菌在酸菜中发挥着极其重要的作用，是酸菜营养和风味的主要来源，乳酸菌的发酵性能直接影响酸菜的品质，对于提高酸菜的营养价值极为重要[3-4]。酸菜中的特殊风味大部分来自于乳酸菌，乳酸菌对于酸菜的作用不言而喻[5]。可以说，只有研究明白了乳酸菌，才能对酸菜有更为深入地了解，也才能更好地传承这项传统工艺。本研究主要筛选东北酸菜的优良发酵微生物，并探究了优良乳酸菌对大肠杆菌的抑菌能力，为后期工业化生产奠定良好的基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

东北酸菜：采自东北，为家庭自制。乳酸标准品（纯度95%）：德国DRE公司；实验所用其他试剂均为国产分析纯。大肠杆菌（Escherichia coli）ATCC25922：由河南科技大学陈俊亮副教授所赠。

MRS培养基[6-7]：蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母膏5 g/L，柠檬酸氢二铵2 g/L，葡萄糖20 g/L，乙酸钠5 g/L，磷酸氢二钾2 g/L，硫酸镁0.58 g/L，硫酸锰0.25 g/L，琼脂18 g/L，pH 6.2～6.6。115℃灭菌30 min。

营养琼脂培养基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化钠5 g/L，琼脂18 g/L，pH 7.2～7.6。115℃灭菌30 min。

1.2 仪器与设备

DK-S12恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司；DM 2000荧光显微镜：莱卡仪器（德国）有限公司；FE-20精密pH计：梅特勒-托利多仪器有限公司；T100 Thermal Cycler PCR仪：美国伯乐BIO-RAD公司；1525型高效液相色谱仪：美国沃特斯公司；SP-250生化培养箱：南京实验仪器厂；MLS-3750立式压力蒸汽灭菌锅：日本SANYO公司；ZHJH-C1115B超净工作台：上海智诚分析仪器制造有限公司；UV1800紫外可见分光光度计：日本岛津公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌株分离纯化

用生理盐水将东北酸菜汁液进行梯度稀释，并取100μL稀释液涂布于MRS平板上，37℃倒置培养过夜，观察长出的单菌落，挑取形态不同的单菌落进行平板划线分离，以达到分离纯化的目的。划线培养进行2～3次，以确保菌株的纯度。三次分离纯化之后，对菌株进行革兰氏染色镜检，并确定菌株形态，将镜检后的菌株接种于MRS液体管中进行传代培养，然后于MRS斜面培养基中划线培养，于4℃冰箱保存，备用。

1.3.2 菌株分子生物学鉴定

将菌株活化后，进行乳酸菌基因组的提取[8]。提取步骤：①取菌体，培养12 h以上，1 mL至1.5 mL EP管，10 000 r/min离心2min，弃上清得菌体。②加入1mL无菌水吹洗菌体后，10 000 r/min离心2 min，弃上清。③加入200 μL十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate，SDS）裂解液80℃水浴30 min。④加入酚-氯仿200μL于菌体裂解液中。⑤加入400μL冰乙醇于200 μL上清液中，-20℃静置超过30 min，12 000 r/min离心5～10 min，弃上清。⑥加入500 μL体积分数为70%冰乙醇重悬沉淀，12 000 r/min离心1～3 min，弃上清。⑦60℃烘箱烘干少于1 min，不能过干。⑧50 μL超纯水重溶沉淀以备聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）。

PCR扩增16S rDNA片段[9]，PCR反应体系（50 μL）：10× buffer 5 μL；脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）5 μL；上游引物（25 μmol/L）0.5 μL；下游引物（25μmol/L）0.5μL；TaqDNA聚合酶（250U）0.5μL；DNA模板1.5μL；超纯水37μL。PCR扩增条件：95℃、1min；95℃、10s；55℃、30s；72℃、30s；72℃、5min；2-4步进行35个循环。上游引物序列：5′-AGAGTTTGATCCTGGCCTCA-3′，下游引物序列：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。扩增后送生工生物工程（上海）有限公司测序，将测序结果使用BLAST在GeneBank中进行搜索和相似性比对，对菌株进行种属鉴定。目前建议的16SrDNA序列分析标准是97%～99%相似者，定为同一个属，99%～100%全序列相似性的细菌，则判定为同一个种。

1.3.3 乳酸产量测定

采用高效液相色谱法测定乳酸含量[10-11]。具体步骤：①样品处理。用移液管准确吸取5.00 mL试样于10 mL容量瓶中，加入1 mol/L磷酸0.2 mL，用重蒸水定容，混匀，经0.22 μm滤膜过滤，备用。②配制溶液。流动相：0.01 mol/L磷酸氢二铵，用1 mol/L磷酸滴定调至pH=2.7，真空过滤、超声脱气备用。10%的甲醇：10 mL超纯水和90 mL甲醇混合，过滤，超声脱气。③配制乳酸标准溶液。称取1.014 2 g乳酸标品置于100 mL容量瓶中，用三蒸水定容至100 mL，配制成质量浓度为10.142g/L的乳酸标准溶液，并过0.45μm微孔纤维素滤膜。④开机并设置高效液相色谱仪。a.设定B泵流量0.4 mL/min，变化率设1～2 min。b.待泵流量稳定之后，用甲醇或10%甲醇冲洗平衡1 h以上，再用流动相磷酸氢二铵平衡。c.待流动相基线平稳后，点击手动进样，然后依次进样获得曲线。d.样品洗脱完后，用流动相清洗XSelect HSS T3色谱柱（5 μm×4.6 mm×250 mm）30 min，再用甲醇洗1 h以上，最后关闭仪器。⑤绘制乳酸标准曲线。取上述乳酸标准溶液1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL、6.00 mL、7.00 mL、8.00 mL、9.00 mL、10.00 mL，加入0.2 mL 1 mol/L磷酸，用超滤水稀释至10 mL混匀后进样。进样在20 μL左右，于波长210 nm处测量峰面积。以乳酸质量浓度（x）为横坐标，色谱峰面积（y）的均值为纵坐标，绘制标准曲线，得出标准曲线回归方程为：y=106x+2×106，相关系数为R2=0.999 37。⑥结果计算。按照回归方程计算样品中乳酸含量。

1.3.4 抑菌能力测定

将筛选的乳酸菌用于对大肠杆菌抑菌能力测定：将已灭菌的素琼脂约10mL倒入平皿内，凝固后后将营养琼脂培养基加热至完全融化，待培养基温度降至不烫手后，加入大肠杆菌，摇匀，倒在培养皿（每皿20 mL）内，待其凝固。在无菌环境下，在培养基表面垂直放上牛津杯（高10 mm、内径6 mm、外径8 mm的圆形小管），轻轻加压，使其与培养基接触无空隙。在杯中加入200 μL待检样品（发酵液），注意勿使其外溢。加满后置37℃条件下培养24～48 h，观察结果，抑菌圈的大小使用游标卡尺进行测量[12]。

2 结果与分析

2.1 菌株的筛选及形态特征

将酸菜汁样品进行梯度稀释和平板涂布后，获得不同形态的单菌落，挑取形态差别较大的菌落共进行划线分离。选择8个平板上形态差异较大的菌株。每个平板用A、B、C、D、E、F、G、H字母表示，共挑选了74株进行进一步分离纯化。将分离纯化后的菌株接种到MRS固体培养基上，于37℃条件下培养24 h，观察菌落形态，再挑取单菌落经革兰氏染色后用油镜观察菌体形态。其中，大多数菌株的菌体呈现杆状，但仍有一些菌体呈球状，以单个或者短链状排列代表菌株的菌落和菌体细胞形态。由图1A可知，菌株C9菌落在培养基上呈现出凸透镜的形状，菌落直径在1.0～2.0 mm左右，圆形、边缘光滑、乳白色。由图1B可知，菌株C9的菌体细胞呈杆状，革兰氏染色结果为阳性。

2.2 生理生化鉴定结果

挑选革兰氏染色结果呈紫色的40株菌进行生理生化鉴定。结果表明，所有菌株过氧化氢反应为阴性。除了菌株D2、E8、H10发酵葡萄糖产CO2，其他菌株发酵葡萄糖不产气。糖发酵实验：菌株D6、G2不发酵阿拉伯糖、蜜二糖、棉子糖和木糖；菌株D2、E8、H10不发酵阿拉伯糖、蜜二糖、棉子糖，但可发酵木糖；其他菌株可发酵阿拉伯糖、蜜二糖、棉子糖和木糖。

图1 菌株C9菌落形态(A)及革兰氏染色结果(B)Fig.1 Colonial morphology(A)and gram straining results(B)of strain C9

2.3 分子生物学鉴定

将革兰氏染色呈阳性的40株菌，提取出菌株基因组之后，将得到的样品送测序分析，序列结果使用BLAST在GeneBank中进行搜索和相似性比对，得到的菌株鉴定结果见表1。

表140 株乳酸菌鉴定结果Table 1 Identification results of 40 stains of lactic acid bacteria

2.4 乳酸菌产乳酸能力测定

酸菜在发酵的过程中，乳酸菌经过三羧酸循环和无氧呼吸等生理过程会发酵产生乳酸、乙酸等各种有机酸，其中乳酸为其中主要的酸性物质，因此其产酸能力也以产乳酸能力为主。酸的产生不仅可以给酸菜带来更好的风味，而且能有效抑制腐败菌的生长。根据发酵总酸含量的比较，挑选产酸量较高的20株乳酸菌。并采用高效液相色谱法测量这20株乳酸菌发酵上清液中的乳酸含量，乳酸标准品及代表菌株D2发酵上清液的高效液相色谱图见图2，检测结果表2。

图2 乳酸标准液(A)和菌株D2发酵上清液(B)的高效液相色谱图Fig.2 HPLC chromatography of lactic acid standard solution(A)and fermented supernatant fluid of strain D2(B)

表220 株乳酸菌产酸情况Table 2 Acid production of 20 strains of lactic acid bacteria

2.5 乳酸菌抑菌能力测定

采用牛津杯法，测定20株乳酸菌对大肠杆菌ATCC25922的抑菌能力，其中抑菌效果最好的为菌株D6、E5、C1，结果见图3。牛津杯周围存在一条明显的透明圈，表明乳酸菌发酵上清液中存在抑制大肠杆菌生长的物质。而菌株E5、C1抑菌圈较大，表明这两株菌抑制大肠杆菌的能力较强，相比而言菌株D6则较弱。20株乳酸菌对大肠杆菌抑菌情况结果见表3。

图33 株乳酸菌抑制大肠杆菌效果Fig.3 Antibacterial effect of three strains of lactic acid bacteria onE.coli

表320 株乳酸菌的抑菌圈直径比较Table 3 Comparison of antibacterial circle diameter of 20 strains of lactic acid bacteria

产乳酸能力与抑菌能力比较分析后可知，随着乳酸菌产酸能力的减弱，抑菌圈直径逐渐变小。分析原因主要是由于加入牛津杯中的不同菌株的发酵上清液中包括乳酸，乙酸等物质的含量不同，从而对致病菌的抑制作用产生差异，如果所含有的抑菌物质较高，则抑菌圈越大。不同的乳酸菌对不同致病菌敏感程度也不同[13]。本研究中，产酸能力最强的菌株C1抑菌圈直径接近15 mm，产酸能力较弱的菌株F11抑菌圈直径不到8 mm，抑菌圈随着产酸能力的削减而呈现下降的趋势。但同时应该看到有部分菌株并不符合这个趋势，这可能是由于这些菌株产乳酸菌素等物质造成[14]。吴海波等[15]对不同地域发酵蔬菜分离的乳酸菌抑菌效果做的研究也表明乳酸菌在生长代谢过程中可以产生包括乳酸在内的过氧化氢、双乙酰、细菌素等多种天然抑菌物质同样可以对腐败菌产生抑制作用。

3 结论

本研究以东北酸菜为研究对象，分离筛选不同东北农家自制酸菜的有益微生物。从自然发酵酸菜中分离出40株乳酸菌。比较并分析了其产乳酸及抑菌能力的关系。结果表明，菌株C1（Lactobacillusplantarum）、E8（Weissellacibaria）、A5（Lactobacillus plantarum）菌株的产酸能力较强，抑菌大肠杆菌能力较强。同时也发现产乳酸能力差的菌株，如菌株C5（Lactobacillus plantarum）、F11（Lactobacillus plantarum）抑菌能力也较差。另外，还有一些菌由于产生其他代谢产物的原因，其产酸量不高，但是抑菌能力相对较强，存在一定差异。由此可见，东北酸菜中的益生菌主要是植物乳杆菌，其在东北酸菜的发酵过程中起重要的作用，可以抑制杂菌污染，保证酸菜品质。

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Screening and antibacterial property of superior lactic acid bacteria from pickled Chinese cabbage in Northeast of China

WANG Lei1,ZHANG Jie1,ZHAO Guozhong2,3*
(1.Tianjin Institute of Food Safety Inspection Technology,Tianjin 300308;2.Key Laboratory of Food Nutrition and Safety,Tianjin University of Science&Technology,Tianjin 300457;3.School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

40 strains of lactic acid bacteria were isolated,purified and identified,includingLactobacillus plantarum,Weissella confuse,Lactobacillus paracasei,Lactobacillus caseiandWeissella cibaria.By determination of lactic acid production and the ability to inhibitEscherichia coli,the relationship between acid production and antimicrobial activity of lactic acid bacteria was investigated.The results showed that the acid-producing ability of strains C1,E8 and A5 was stronger than other strains.After fermentation for 12 h,the lactic acid content in fermented supernatant fluid was more than 12 g/L,the diameter of inhibition zone was more than 12 mm and it had stronger ability to inhibitE.coli.The results indicated that the acid production of lactic acid bacteria in pickled Chinese cabbage in Northeast of China had a close relationship with antimicrobial activity.

pickled Chinese cabbage in Northeast of China;lactic acid bacteria;screening;acid production;antibacterial property

TS255.54

0254-5071（2017）07-0048-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.07.011

2017-04-11

国家自然科学基金青年项目（31401682）；江苏省科技计划项目青年基金（BK20140146）

王磊（1984-），男，助理工程师，本科，研究方向为食品微生物检测。

*通讯作者：赵国忠（1983-），男，副教授，博士，研究方向为食品微生物学。