盐酸菜中降胆固醇、亚硝酸盐乳酸菌筛选及功能特性研究

曾承露，李锋*，黄德娜

（黔南民族师范学院化学化工学院，贵州都匀558000）

盐酸菜中降胆固醇、亚硝酸盐乳酸菌筛选及功能特性研究

曾承露，李锋*，黄德娜

（黔南民族师范学院化学化工学院，贵州都匀558000）

以独山传统工艺制作盐酸菜液为研究对象，运用涂布法分离纯化乳酸菌。采用生理生化试验和分子生物学法，鉴定菌株Y-12为棉籽糖乳球菌（Lactococcus raffinolactis）。运用比色法测定其对胆固醇和亚硝酸盐清除能力，该菌株对胆固醇和亚硝酸盐的降解率分别为78.15%和75.17%。对菌株Y-12进行耐酸、耐盐和耐胆盐试验研究，结果表明，菌株Y-12在pH值为≥2.5的酸性环境中能正常生长，能够耐受5%NaCl和0.3%胆盐。

棉籽糖乳球菌；胆固醇；亚硝酸盐；乳酸菌

独山盐酸菜是布依族以独特传统制作工艺老坛自然发酵而成的蔬菜食品。因其香气扑鼻，色泽鲜艳，口感酸中有辣，辣中有甜，甜中有咸，风味独特而深受喜爱。但传统腌制工艺存在品质难以控制、发酵周期长等缺点，不利于规模化、标准化生产。目前，国外发酵蔬菜行业利用人工接种发酵控制产品质量稳定性，取得较好进展[1]。传统盐酸菜发酵过程中起主要作用的功能菌是乳酸菌，因此本研究计划从盐酸菜中筛选优良功能乳酸菌进行纯培养，解决传统制作工艺发酵周期长等弊端。

近年来研究发现，乳酸菌除了可以提高食品营养价值和改善风味，其还具有特殊生理活性和营养功能，如调节肠道菌群微生态平衡[2-3]，清除人体自由基，还可以降低食物和人体血清胆固醇含量，从而降低心脑血管发病几率[4-7]。此外，发酵蔬菜在腌制过程中会产生亚硝酸盐，长期食用高含量亚硝酸盐食品会给人们的健康带来众多问题。但有相关研究表明，乳酸菌在生长代谢过程中可以降解亚硝酸盐，从而来保证食品质量与安全[8-10]。由此可见，筛选优良功能乳酸菌并研究其代谢特性是一项非常有应用价值的研究工作。

本研究旨在从独山盐酸菜中筛选出具有降胆固醇和亚硝酸盐的优良功能特性的乳酸菌，利用分子生物学对其进行鉴定，并研究其降胆固醇及亚硝酸盐的能力等，以期将其作为接种剂进行盐酸菜发酵研究及潜在的直投式发酵剂工业化生产提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

盐酸菜：独山农户采用传统工艺方法制作的3份自然发酵不同口味（酸辣、爽辣和酸甜）盐酸菜。

MRS培养基和CaCO3-MRS培养基参照文献[11]配制；牛胆盐（生化试剂）、胆固醇、邻苯二甲醛、盐酸萘乙二胺（均为分析纯）、亚硝酸盐标准溶液（100 mg/L），聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增试剂、Ezup柱式细菌基因组脱氧核糖核酸（deoxyribose nucleic acid，DNA）试剂盒、琼脂糖、通用引物：上海生工生物工程有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

MLS-3750高温蒸汽灭菌锅：日本SANYO公司；5804R小型台式离心机：德国Eppendoff公司；730R回转式振荡恒温培养箱：美国APlus公司；FE-20KpH计：梅特勒-托利多仪器有限公司；SW-CJ-20型超净工作台：苏州华科净化设备有限公司；MyCycler PCR仪：美国Bio-Rad生命医学产品有限公司；DYY-6D电泳仪：北京六一生物科技有限公司；WGD-30S凝胶成像仪：韩国Wisd公司；UV-1200紫外分光光度计：上海美普达仪器有限公司；DM2500徕卡生物荧光显微镜：德国徕卡公司。

1.3 实验方法

1.3.1 菌株分离及筛选

盐酸菜汁液经无菌生理盐水稀释10-1～10-4后吸取100 μL涂布于CaCO3-MRS培养皿中，30℃培养24～48 h后，观察培养基中菌落形状、颜色、表面光滑度等，挑取产生溶钙圈较大的单菌落继续分离纯化。单菌落经3次分离纯化后进行革兰氏染色，对革兰氏阳性菌和触酶阴性菌进一步研究[12-13]，并用20%甘油保藏于-80℃冰箱。

1.3.2 生理生化特征鉴定

根据菌株的表型特征和革兰氏染色结果，并通过淀粉水解实验、氧化酶实验、吲哚实验、石蕊牛乳实验、V-P实验等，参照《乳酸细菌分离鉴定及实验方法》[14]和《伯杰细菌鉴定手册》[15]中描述的反应特征，鉴定菌株分类学地位。

1.3.3 分子生物学鉴定

细菌DNA提取采用Ezup柱式细菌基因组DNA试剂盒，按照说明书操作进行提取，并以此基因组为模板，对其进行16S rRNA基因PCR扩增。正向引物27F：5-AGAGTT TGATCCTGGCTCAG-3，反向引物1492R：5-GGTTACCTT GTTACGACTT-3。

PCR反应体系（50μL）：模板1μL，10×PCR缓冲液5μL，Mg2+3μL，dNTP（25mmol/L）1μL，引物（10mmol/L）1μL，Taq酶0.5μL，超纯水37.5μL。PCR反应程序：94.0℃预变性4 min；94℃变性1 min，54℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，循环29次；72℃延伸7 min；4℃保存。PCR反应结束后，取5 μL左右的PCR产物进行电泳及凝胶成像检测。

细菌PCR产物送上海生工进行测序，将测序结果提交美国国家生物技术信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）网站BLAST数据库进行比对，确定菌株的菌属，再经MEGA5.05软件构建菌株的系统发育树，以确定其分类学地位。

1.3.4 乳酸菌降解胆固醇性能测定

降胆固醇能力测定参照文献[16]报道的邻苯二甲醛法，以胆固醇质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制胆固醇标准曲线回归方程为：y=0.004 657x+0.001 86，相关系数R2=0.998。以接种量2%（V/V）将菌株接种于含有100 μg/mL胆固醇的MRS培养基中，30℃培养，分别在培养时间为12h、24h、36h、42h、48h时取样，在波长550nm处测定残余胆固醇吸光度值，代入胆固醇标准曲线计算剩余胆固醇含量和降解率。降解率计算公式如下：

式中：A0为培养基胆固醇初始质量浓度，μg/mL；A1为发酵后残余胆固醇质量浓度，μg/mL。

1.3.5 乳酸菌降解亚硝酸盐性能测定

降亚硝酸盐能力测定参照国标GB 5009.33—2016《食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐》中规定的盐酸萘乙二胺法[17]，以亚硝酸盐质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制亚硝酸盐标准曲线回归方程为：y=0.805x+0.044 602，相关系数R2=0.995，以接种量为2%（V/V）接种于含有10 mg/L亚硝酸钠的MRS培养基中，30℃培养，分别在培养时间为12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h时取样，在波长538 nm处测残余亚硝酸盐吸光度值，代入亚硝酸盐标准曲线回归方程计算剩余亚硝酸盐含量和降解率。降解率计算公式如下：

式中：B0为培养基亚硝酸盐初始质量浓度，mg/L；B1为发酵后残余亚硝酸盐质量浓度，mg/L。

1.3.6 乳酸菌耐酸性能测定

将2%（V/V）菌种接种于pH值为1.5、2.5、3.5、4.5的MRS培养基中，30℃培养12 h，每隔3 h取样在波长600 nm处测定吸光度值，吸光度值越大，表明菌体生物量越大。考察菌株在不同pH值培养基中的生长情况。

1.3.7 乳酸菌耐盐性能测定

将菌种以2%（V/V）接种量接种于添加2%、4%、5%、6%、8%NaCl的MRS培养基中，30℃培养12 h，每隔3 h取样在波长600 nm处测定吸光度值，考察菌株在不同盐浓度培养基的生长情况。

1.3.8 乳酸菌耐胆盐性能测定

将菌种以2%（V/V）接种量分别接种于添加含0.1%、0.2%、0.3%胆盐的MRS液体培养基中，30℃培养12 h，每隔3 h取样在波长600 nm处测定吸光度值，考察菌株在不同胆盐含量培养基的生长情况。

2 结果与分析

2.1 菌落形态及菌体特征

图1 菌株Y-12菌落形态（左）及显微形态（右）Fig.1 Colonial morphology(left)and microscopic observation(right) of strain Y-12

通过划线纯化培养，从盐酸菜汁液中分离得到27株菌，选取在CaCO3-MRS培养基上溶钙圈较大的菌株Y-12，观察菌株生长颜色、大小及菌落形态并进行显微镜观察，结果见图1。由图1可知，菌株呈现乳白色、圆形、表面光滑圆润，不透明，边缘整齐。革兰氏染色为阳性，显微镜下观察菌体呈球状。

2.2 生理生化特征

菌株Y-12生理生化试验检测结果见表1。由表1可知，菌株Y-12接触酶反应、淀粉水解、吲哚产生、H2S产生和明胶液化试验结果均为阴性，石蕊牛奶和V-P试验结果呈阳性，可以利用葡萄糖、纤维二糖和棉籽糖等碳水化合物，查阅《乳酸菌分类鉴定手册》初步判断菌株Y-12为乳球菌属（Lactococcussp.）。

表1 菌株Y-12的生理生化特性检测结果Table 1 Detection results of physiological and biochemical characteristics of stain Y-12

2.3 分子生物学鉴定

2.3.1 16S rRNA基因序列PCR扩增结果

图2 菌株Y-12的16S rRNA基因序列PCR扩增产物电泳图谱Fig.2 Electrophoresis of PCR amplification products of 16S rRNA gene sequence of strain Y-12

将细菌基因组进行16S rRNA基因序列PCR扩增，扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。由图2可知，PCR扩增后目的片段在1 500 bp处有特异性条带并且无拖尾现象，阴性对照（2泳道）无条带，说明PCR扩增效果好，可满足测序要求。

2.3.2 构建系统发育树

将PCR扩增序列提交到NCBI，通过Blast工具的Nucleotide collection（nr/nt）数据库进行同源性比对，选取同源性较高的菌株构建系统发育树，结果如图3所示。由图3可知，菌株Y-12与棉籽糖乳球菌（Lactococcus raffinolactis）系统位置最为接近，同源性达到99%。结合菌株的菌落形态、生理生化特性及16S rRNA基因序列分析，菌株Y-12被鉴定为棉籽糖乳球菌（Lactococcus raffinolactis）。

图3 菌株Y-12 16S rRNA基因序列系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of strain Y-12

2.4 菌株Y-12功能特性

2.4.1 降胆固醇特性

图4 菌株Y-12降解胆固醇能力Fig.4 The cholesterol-degrading ability of strain Y-12

考察菌株Y-12的降胆固醇能力，结果见图4。由图4可知，随着培养时间的增加，胆固醇降解率逐渐增高；当培养时间为36 h时，胆固醇降解率达到75.98%，继续培养，胆固醇降解率趋于平稳，这可能是因为乳球菌生长处于稳定期，菌体代谢活力较强，因此降解率较高，最高达到78.15%。与已报道高达92.28%的乳球菌[6]相比，降解率偏低，但与大部分乳酸菌[11]（降解胆固醇能力最高的菌株SR10降解率为33.64%）相比，该菌株的降解胆固醇能力较高，表明菌株Y-12具有优良的胆固醇降解特性。

2.4.2 降亚硝酸盐特性

亚硝酸盐会在蔬菜发酵过程中产生，食量超标会对身体健康带来危害[19]。因此，清除或者降低发酵蔬菜中亚硝酸含量是较为有效的控制手段。考察菌株Y-12的降亚硝酸盐能力，结果如图5所示。由图5可知，菌株Y-12的亚硝酸盐降解率随培养时间延长逐渐增大。当培养时间为60 h时，亚硝酸盐降解率达到74.25%，继续延长培养时间，降解率增长趋于平缓，72 h时达到75.17%；与已报道的乳酸菌[6]的亚硝酸盐降解率（20%～90%）相比，表明菌株Y-12具有较高的亚硝酸盐降解能力。

图5 菌株Y-12降解亚硝酸盐能力Fig.5 Nitrite degrading ability of strain Y-12

2.4.3 耐酸特性

图6 不同pH条件下菌株Y-12的生长情况Fig.6 Growth situation of strain Y-12 in the condition of different pH

通常情况下，人体胃中的pH值一般在0.9～1.5范围内波动，进食后一般会上升到3.0～4.0左右[20]。考察菌株Y-12在不同pH值培养基中的生长情况，结果见图6。由图6可知，随着pH值的增加，菌液吸光度值呈上升趋势，说明菌体生物量也逐渐增加。培养基pH为2.5时，前6 h菌体生物量变化不大，6 h之后，菌体量开始增长，说明乳球菌的酸耐受反应系统在酸性环境被诱导激发，菌体得到存活能力。当pH为1.5时，菌体生物量始终处于最低水平，且随培养时间的延长基本没有发生变化，乳球菌生长明显受到抑制。综上所述，菌株Y-12具有一定的耐酸能力。

2.4.4 耐盐特性

考察不同盐含量对菌株Y-12生长情况的影响，结果见图7。由图7可知，随着培养基中NaCl含量不断升高，菌液吸光度值在逐渐减小。在NaCl含量为2%～5%时，菌株Y-12的生长代谢影响不大，菌液吸光度值为0.537～0.982，盐含量越低，生长趋势越好。当NaCl含量上升到6%和8%时，培养12 h后，菌液吸光度值基本没有发生变化，表明菌株Y-12的生长受到抑制。由此可见，菌株Y-12在NaCl含量为5%以下时，具有一定耐受力。

图7 不同盐含量下菌株Y-12生长情况Fig.7 Growth situation of strain Y-12 in the condition of different salt concentration

2.4.5 耐胆盐特性

图8 不同胆盐浓度下菌株Y-12生长情况Fig.8 Growth situation of strain Y-12 in the condition of different bile salt concentration

人体小肠中胆盐含量正常值在0.03%～0.30%之间，乳酸菌必须具备较强胆盐耐受性，才能在此环境下正常生长繁殖，发挥其功能作用[21]。考察菌株Y-12在不同含量胆盐含量培养基中的生长情况，结果见图8。由图8可知，随着胆盐浓度升高，菌液吸光度值呈下降趋势。当胆盐含量为0.3%时，培养6 h后，OD600nm值才开始发生变化，可能是菌株逐渐产生了耐受性而继续生长。考虑到正常人体小肠胆盐含量最高为0.3%，故不继续考察高浓度胆盐耐受性。关于乳酸菌耐胆盐相关研究，发现大部分乳酸菌能够耐受0.2%～0.4%的胆盐浓度[22]。在小肠正常胆汁浓度下，菌株Y-12具有良好抗胆汁能力。

3 结论

本实验以独山自然发酵盐酸菜为原料，筛选到一株降解胆固醇和亚硝酸盐乳酸菌，经形态学观察、生理生化鉴定和分子生物学鉴定。结果表明，菌株Y-12为棉籽糖乳球菌（Lactococcus raffinolactis）。通过比色法测定菌株Y-12的胆固醇降解能力和亚硝酸盐清除能力分别为78.15%和75.17%。对菌株Y-12的耐受性进行考察，发现菌株Y-12在pH值为2.5的酸性环境和0.3%胆盐环境中能够正常生长；在NaCl含量为5%以下，其生长不受抑制。本实验的乳球菌筛自蔬菜发酵食品，食用安全性得到保障，且此菌具有较好耐盐、耐酸和耐胆盐特性，为进一步研究其潜在益生特性奠定基础。

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Screening and functional property of cholesterol-and nitrite-degrading lactic acid bacteria from pickled vegetable

ZENG Chenglu,LI Feng*,HUANG Dena
(School of Chemistry and Chemical Engineering,Qiannan Normal College for Nationalities,Duyun 558000,China)

Lactic acid bacteria were separated and purified from pickled vegetable produced by Dushan traditional fermentation process by spread plate method.Strain Y-12 was identified asLactococcus raffinolactisby physiological biochemical tests and molecular biology method.The scavenging activity of the strain Y-12 on cholesterol and nitrite was determined by colorimetric method.The degradation rate of strain Y-12 on cholesterol and nitrite were 78.15%and 75.17%,respectively.The results of acid resistance,salt resistance and bile salt resistance tests showed that strain Y-12 was able to grow in acidic environment(pH≥2.5),and could tolerate 5%NaCl and 0.3%bile salts.

Lactococcus raffinolactis;cholesterol;nitrite;lactic acid bacteria

TS201.3

0254-5071（2017）07-0037-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.07.009

2017-02-27

贵州省教育厅自然科学研究重点项目（黔教合KY[2014]286）；贵州省科学技术联合基金项目（黔科合LH字[2014]7418）

曾承露（1986-），女，讲师，硕士，研究方向为食品微生物。

*通讯作者：李锋（1982-），男，讲师，博士研究生，研究方向为生物化工过程。