浓香型白酒窖泥中芽孢杆菌的分离鉴定及代谢产物分析

刘燕梅，王艳丽，汪文鹏，李永博，吴树坤，刘梅，黄治国*

（1.宜宾市产品质量监督检验所，四川宜宾644000；2.四川理工学院酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川自贡643000；3.安徽古井集团有限责任公司技术质量中心，安徽亳州236800）

浓香型白酒窖泥中芽孢杆菌的分离鉴定及代谢产物分析

刘燕梅1，2，王艳丽2，3，汪文鹏2，李永博2，吴树坤2，刘梅2，黄治国2*

（1.宜宾市产品质量监督检验所，四川宜宾644000；2.四川理工学院酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川自贡643000；3.安徽古井集团有限责任公司技术质量中心，安徽亳州236800）

从浓香型白酒窖泥中筛选出3细菌，经磷脂脂肪酸（PLFA）鉴定，分别为球形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus sphaerieus）、短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevis）、尘埃类芽孢杆菌（Paenibacillus larvaesubsup.pulvifaciens）。采用固相微萃取结合气相色谱-质谱联用（SPME-GC-MS）技术分析3株菌发酵产物，结果表明，3株菌产风味物质能力较强且种类丰富，主要为高级醇、高级酮等芳香类化合物，它们作为白酒中的微量成分，对浓香型白酒风味的形成起着放香、助香及调香的作用。因此，这3株菌的代谢产物对浓香型白酒风味物质的形成有一定影响。

浓香型白酒；窖泥；芽孢杆菌；分离；磷脂脂肪酸鉴定；代谢产物分析

白酒是世界五大蒸馏酒之一，具有多种不同的香型，其中浓香型白酒在中国白酒行业有着重要的地位。窖池微生物在白酒酿造过程中对白酒产量、质量有着重要的影响，其代谢产物是白酒呈香呈味物质的基础。赵爽等[1]研究发现，在白酒的酿造过程中，微生物与白酒的风味之间有着一定的联系。张霞等[2]研究发现，浓香型白酒窖泥中可培养细菌主要是芽孢杆菌（Bacillus），以地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）为主，也存在少量球形芽孢杆菌（Bacillus sphaericus），及极少量的短芽孢杆菌属（Bacillus brevis）。叶光斌等[3]利用基因文库法研究发现窖泥中含有大量的芽孢杆菌属，经克隆文库测序发现，有16个克隆子与可培养的同源性较高，如芽孢杆菌属、枝芽芽孢杆菌属（Virgibacillus）以及Lysinibacillus。芽孢杆菌属是白酒酿造中的主要原核微生物，因此探究其种属及发酵特性对浓香型白酒生产及风味物质的产生有着重要的意义。

目前，针对微生物的鉴定方法有基于聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术的脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）测序、Biolog微生物鉴定、磷脂脂肪酸（phosphor lipid fatty acid，PLFA）分析技术等。PLFA分析技术是一种基于生物化学手段的一种微生物生态学研究技术，是一种快速且可靠的分析检测方法[4]，它是活体微生物细胞膜的成分且含量相对稳定，具有多样性和生物学特异性，易于提取进行定性、定量的研究[5]。脂类物质是构成生物细胞膜的成分，在细胞中含量稳定，约占细胞干质量的5%[6]。在细胞中含有脂肪酸的脂类物质只有碳水化合物、脂性醇、磷脂和糖脂等，通常这种脂类物质的组成和含量在同一种微生物中是稳定和可遗传的[7]。PLFA谱图分析方法的原理是基于脂类几乎是所有生物细胞膜的重要组成成分，不同微生物体内磷脂脂肪酸组成和含量水平不同，其含量与结构有着种属特异性，能够标记某一类或某一种特定微生物的存在，是一类最常见的生物标记物[8]。Sherlock MIS微生物自动鉴定系统是美国MIDI公司20世纪90年代研发出来的，该系统拥有一套完整的标准化程序，备有图谱识别软件以及迄今为止微生物鉴定系统中最大的数据库资源，而且操作简单、分析周期短，因而该方法在微生物领域得到了广泛的应用[9-12]。因此，本研究采用PLFA分析技术对浓香型白酒窖泥中分离筛选出的芽孢杆菌进行鉴定，并运用气相色谱-质谱联用（gaschromatographymass spectrography，GC-MS）技术分析分离菌株发酵产物，以期获得该微生物对白酒风味物质所起的作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

窖泥样品采自泸州老窖股份有限公司白酒生产窖池，100年窖龄窖池。于窖壁上层（距窖口50 cm）、下层（距窖底50 cm）和窖底（窖池底部）分别取样，迅速置于冰盒运回，4℃保藏。

1.1.2 培养基与试剂

牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、琼脂20 g、蒸馏水1 L，121℃灭菌15 min。

液体培养基：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、蒸馏水1 L，121℃灭菌15min。

固体培养基：本地产优质高粱。高粱按60目粉碎后加水调配，以121℃、80 min蒸粮灭菌，冷却至30℃。

NaCl、氢氧化钠、浓盐酸（均为分析纯）：成都科龙化工试剂厂；甲醇（色谱纯）：德国Darmstadt公司；正己烷（色谱纯）：美国Fisher Scientific公司；甲基叔丁基醚（色谱纯）：瑞典Telia公司。

皂化试剂：45 g氢氧化钠溶于150 mL甲醇及150 mL蒸馏水；

甲基化试剂：325 mL 6 mol/L的盐酸加入275 mL甲醇中，混合均匀；

萃取试剂：加200 mL甲基叔丁基醚到200 mL正己烷中，混合均匀；

碱洗涤试剂：10.8 g氢氧化钠溶于900 mL蒸馏水。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-2D超净工作台：江苏苏净集团有限公司。ZHWY-103D恒温培养振荡器：上海智城分析仪器制造有限公司；LRH-250生化培养箱：上海齐欣科学仪器有限公司；E200正置生物显微镜：尼康正置显微镜公司：MLS-3020全自动高压蒸汽灭菌锅：北京艾飞博科技有限公司：XMTD水浴锅：余姚长丰仪器厂；Supelco 57250-U固相萃取仪：美国TALBOYS公司；Sherlock MIS微生物鉴定系统：美国MIDI公司；GC6890气相色谱仪、GC7890-5975MSD气相色谱-质谱联用仪：美国安捷伦科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 微生物的分离与纯化

将窖池上、下、底不同位置的窖泥混合后，从中称取10g窖泥样品进行10倍梯度稀释，取稀释液1 mL涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基，置于37℃培养箱。待菌落长出后对不同菌落进行分离纯化，同时将筛出的不同菌株用斜面保存，并对其进行生化鉴定。

1.3.2 分离菌株PLFA的提取[13]

将已分离纯化待鉴定菌种按照四区划线法分别接种在牛肉膏蛋白胨培养基上，于37℃恒温培养细菌24 h。挑取培养基上已培养好的第三区菌落（约40 mg）于10 mL有聚四氟乙烯塞的玻璃瓶中，再通过皂化、甲基化、萃取、碱洗涤对菌的磷脂脂肪酸进行提取。具体步骤如下：

（1）皂化：称取40 mg单菌培养物，置于8 mL螺口玻璃管中，加入1 mL皂化试剂，拧紧螺盖，沸水浴5 min，取出振荡5～10 s，拧紧螺盖，继续沸水浴25 min；

（2）甲基化：待样品管冷却后，加入2 mL甲基化试剂，盖严振荡，随后精确控制（80±1）℃水浴10 min，冷水浴冷却至室温；

（3）萃取：在冷却的样品管中加入1.25 mL萃取试剂，快速振荡10 min左右，弃去下层水相；

（4）碱洗涤：在剩余有机相中加入3 mL碱洗涤试剂，快速振荡5min左右，振荡完若静置后不分层可向其中加几滴饱和氯化钠溶液，取2/3上层有机相置于气相色谱样品瓶中，保存于冰箱中待检。

1.3.3 PLFA鉴定

将待检样品置于气相色谱上进行测定，采用氢火焰离子检测器，气相色谱的各参数由MIDI-Sherlock微生物鉴定系统调用。

色谱条件：HP-ULTRAz色谱柱（30.0 m×0.25 mm× 0.25μm）；进样量：1μL，进样口温度250℃；不分流进样；程序升温：初始温度190℃，以10℃/min的速率升温至285℃，再以60℃/min的速率升温至310℃。火焰离子化检测器（flame ionization detector，FID）温度260℃，氢气30 mL/min，空气400 mL/min，尾吹气：氮气30 mL/min。

1.3.4 发酵产物成分分析

先用牛肉膏液态培养基，于37℃培养箱中富集培养，当菌体长到对数期时再接入发酵醅中。液体培养温度条件与固态一致，液态为200 r/min摇床振荡2 d，固态发酵10 d（置于37℃恒温培养箱中发酵）。发酵结束后，取适量固态发酵醅样品进行顶空固相微萃取，GC-MS对发酵产物进行分析，工作站平台标准库进行成分检索。

顶空固微相萃取操作过程：精确量取3 g固态发酵样品于顶空瓶中，将顶空瓶放入全自动固相微萃取仪中，55℃平衡10 min后，萃取30 min。

GC-MS的风味分析条件：DB-WAX毛细管色谱柱（60.0 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度250℃；分流比20∶1；程序升温：初始温度40℃，保持1min，以5℃/min的速率升温至130℃，保持1 min，再以8℃/min的速率升温至230℃，保持4 min；质谱接口温度：240℃；离子源温度：200℃；四极杆温度为150℃；溶剂延迟3 min；离子化方式：电子电离（electron ionization，EI）源；电子能量：70 eV；扫描方式：全扫描。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离

本试验从浓香型白酒窖泥中成功分离得到3株细菌，分别编号为A1、A2、A3。对分离纯化后的3株菌进行革兰氏染色和镜检试验，结果见图1。由图1可知，株菌A1、A2呈白色，A3呈乳白色，且都具有细菌菌落的形态特征：湿润、较光滑、较透明、较粘稠、易挑取、质地均匀。经革兰氏染色及镜检可知，3株菌均为革兰氏阳性菌。

图1 分离菌株的菌落形态（A）及菌体特征（B）Fig.1 Colony morphology(A)and microbial characteristics(B)of isolated strains

2.2 PLFA测定结果

通过皂化、甲基化、萃取、碱洗涤之后，提取3株细菌的磷脂脂肪酸，运用MIDI-Sherlock微生物鉴定系统进行了菌种鉴定，结果如表1所示。根据MIDI微生物鉴定系统的标准，第一选择相似性指数＞0.500，且第一选择相似性指数与第二选择相似性指数相差＞0.100，则认为鉴定成功，其准确性更高，其结果为第一选择；若第一选择相似性指数在0.300～0.500，且第一选择与第二选择之间的相似性指数差值＞0.100，则认为第一选择与第二选择分开，鉴定可能成功，其准确性较低，该菌株为典型菌株；当相似性值＜0.300时，则鉴定不成功[13]。因此，在对结果进行分析时，一般都选用第一相似性指数＞0.500，且与第二相似性指数之差＞0.100的结果为最终结果。MIDI-Sherlock微生物鉴定系统内有大量菌株的磷脂脂肪酸数据库，且每次用气相进行检测时会用磷脂脂肪酸的标准物质进行比较分析，因此其结果是可信的。

表1 MIDI微生物鉴定系统鉴定结果Table 1 Identification results of MIDI microbial identification system

由表1可知，3株菌的相似性指数均＞0.500，所以其结果是可取的。菌株A1被鉴定为球形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus sphaerieus），菌株A2被鉴定为短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevis），菌株A3被鉴定为尘埃类芽孢杆菌（Paenibacillus larvae pulvifaciens）。这3株菌虽然在相关文献中有介绍，但在发酵方面研究较少，因此探究其代谢产物对酿酒微生物的研究有着重要意义。

2.3 代谢产物分析

表2 分离菌株代谢产物分析结果Table 2 Analysis results of metabolic products of isolated strains

浓香型白酒酿造是典型的固态发酵，为了探究分离菌株在白酒酿造过程中的呈味作用，本研究对菌株A1、A2和A3进行固态纯高粱发酵，并采用气相色谱-质谱联用法分析其代谢产物，采用色谱工作站对这3株菌的GC-MS图谱进行自动积分，采用归一化法定性分析代谢产物，其成分分析结果见表2。

白酒中乙醇和水是其主干成分，比例达到98%～99%，其他成分由种类多样的物质组成[14]。中国白酒的微量成分主要为醇类、酯类、酸类、羟基化合物、缩醛、含氮化合物、含硫化合物、呋喃类化合物、酯类化合物、醚类等，酒中的微量成分是决定白酒香气、口感和风格的关键。按照微量成分在白酒中所起作用又分为主体香成分、助香成分、定香成分、矫香成分、放香成分、前香和后香成分、特征成分、骨架成分等。按照微量成分在白酒中的绝对含量可以分为骨架成分和复杂成分[16]。

由表2可知，这3株菌的代谢产物中总共有15种白酒风味成分，其中醇类7种，酮类物质5种，其余的为吡嗪类、酸类、酚类物质。这3株菌的优势产物都为3-羟基-2-丁酮（乙偶姻），其最高含量达64.261%，另外还产少量高级醇、高级酮等风味物质。其中球形赖氨酸芽孢杆菌还优势产2-3-丁二醇，其含量为17.080%，以及微量的乙醇；尘埃类芽孢杆菌产物还有微量2-戊酸，含量为0.164%；类短短芽孢杆菌的产物中还有微量的4-甲基吡嗪，含量为0.051%。在他们的代谢产物中包含有白酒中的主要醇类物质异戊醇、异丁醇，他们是白酒醇甜和助香剂的主要物质来源，对白酒风味的形成及促使酒体丰满、浓厚有重要作用。3-羟基-2-丁酮（乙偶姻）、2-3-丁二醇是4-甲基吡嗪的重要前体物质[15]；而吡嗪类化合物具有青椒的香气和焙烤香；3-羟基-2-丁酮、2-3-丁二醇等羰基化合物对白酒的香气起着助香的作用[14]。在这3株菌的代谢产物中含有大量的3-羟基-2-丁酮、2-3-丁二醇，因此可以看出这3株菌的代谢产物对白酒的香气起着助香的作用。在白酒的微量成分中，酸类物质赋予白酒的丰满和酸刺激感，是影响后味的主要因素；酯类物质使白酒具有水果香气；愈创木酚等酚类物质在白酒中含量不多，但在白酒中起着助香的作用，使酒味绵长[14]。在这三株菌的代谢产物中，含有微量的2-戊酸、愈创木酚，故可以得出这些菌株对白酒风味物质的形成有一定的影响。

3 结论

本研究通过传统的分离方法，从浓香型白酒窖泥中分离得到3株菌，经磷脂脂肪酸鉴定后，菌株A1、A2和A3分别被鉴定为球形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus sphaerieus）、尘埃类芽孢杆菌（Paenibacillus larvae pulvifaciens）、短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevis）。分析其代谢产物，主要为醇类、酮类等物质，它们作为白酒中的微量成分，对浓香型白酒风味的形成起着放香、助香及调香的作用。因此，这3株菌对浓香型白酒风味物质的形成有一定影响。

[1]赵爽，杨春霞，窦灿，等.白酒生产中酿酒微生物研究进展[J].中国酿造，2012，31（4）：5-10.

[2]张霞，武志芳，张胜潮，等.贵州浓香型白酒窖池可培养细菌系统发育分析[J].酿酒科技，2010（12）：23-27.

[3]叶光斌，罗惠波，杨晓东，等.基于免培养法研究泸州地区浓香型白酒窖泥原核微生物群落[J].食品科学，2013，34（17）：176-181.

[4]陈振祥，于鑫，夏明芳，等.磷脂脂肪酸分析方法在微生物生态学中的应用[J].生态学杂志，2005，24（7）：828-832.

[5]吴愉萍.基于磷脂脂肪酸分析技术的土壤微生物群落结构研究[D].杭州：浙江大学，2009.

[6]LECHEVALIER M P.Lipids in bacterial taxonomy-a taxonomist's view [J].Crit Rev Microbiol,1997,5(2):109-210.

[7]HAACK S K,GARCHOW H,ODELSON D A,et al.Accuracy,reproducibility and inter-prettion of fatty acid methyl ester profiles of model bacterial communities[J].Appl Environ Microbiol,1994,60(7):2483-2493.

[8]杜宗敏，杨瑞馥.生物标记物在微生物鉴定和检测中的应用[J].微生物学免疫学进展，2003，31（3）：67-73.

[9]ZHENG J,LIANG R,ZHANG L Q,et al.Characterization of microbial communities in strong aromatic liquor fermentation pit muds of different ages assessed by combined DGGE and PLFA analyses[J].Food Res Int, 2013,54(1):660-666.

[10]BUYER J S,SASSER M.High throughput phospholipid fatty acid analysis of soils[J].Appl Soil Ecol,2012,61:127-130.

[11]MROZIKA,NOWAKA,PIOTROWSKA-SEGETZ.Microbial diversity in waters,sediments and microbial mats evaluated using fatty acid-based methods[J].Int J Environ Sci Technol,2014,11(5):1487-1496.

[12]ARIA S,SYLVIE H,QUIDEAU A.Long-term effects of organic amendments on the recovery of plant and soil microbial communities following disturbance in the Canadian boreal forest[J].Plant Soil,2013, 363(1):331-344.

[13]吴愉萍，徐建明，汪海珍，等.Sherlock MIS系统应用于土壤细菌鉴定的研究[J].土壤学报，2006，43（4）：642-647.

[14]海超.清香型白酒酒龄鉴别的方法研究[J].食品科学，2012，33（10）：184-189.

[15]范文来，徐岩.中国白酒风味物质研究的现状与展望[J].酿酒，2007，34（4）：31-37.

[16]李维青.雏议白酒中微量成分的分类[J].酿酒，2006，33（5）：29-30.

Screening,identification and metabolites analyses ofBacillusin pit mud of Luzhou-flavorBaijiu

LIU Yanmei1,2,WANG Yanli2,3,WANG Wenpeng2,LI Yongbo2,WU Shukun2,LIU Mei2,HUANG Zhiguo2*
(1.Yibin Product Quality Supervision and Inspection Institute,Yibin 644000,China;2.Liquor Making Bio-Technology& Application Key Laboratory of Sichuan Province,Sichuan University of Science&Engineering,Zigong 643000,China; 3.The Technical Quality Center of Anhui Gujing Distillery Company Limited,Bozhou 236820,China)

Three strains of bacteria were screened from the pit mud of Luzhou-flavorBaijiu.Through phospholipid fatty acid(PLFA)identification,the strains were identified asLysinibacillus sphaerieus,Brevibacillus brevisandPaenibacillus larvaesubsup.pulvifaciens,respectively.The fermentation products of three strains were analyzed by solid phase microextraction combined with gas chromatography-mass spectrometry(SPME-GC-MS).The results showedthatthreestrainshadstrongabilitytoproduceflavorsubstanceswhichhadvariouskinds,mainlyforaromaticcompounds(includingalcoholsand ketones).As the trace components inBaijiu,the aromatic compounds played an putting incense,helping incense and blending incense role in the formation ofBaijiuflavor.Therefore,the metabolic products of three strains had certain effect on the formation of flavor substances in Luzhou-flavorBaijiu. Key words：Luzhou-flavorBaijiu;pit mud;Bacillus;screening;PLFA identification;metabolite analysis

TS261.1

0254-5071（2017）07-0076-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.07.017

2017-03-14

固态发酵资源利用四川省重点实验室开放基金项目（2015GTY004）；地方高校国家级大学生创新创业训练计划项目（201210622014）；泸州老窖科研奖学金项目（131jzk03）

刘燕梅（1988-），女，助理工程师，硕士，研究方向为酿酒生物技术。

*通讯作者：黄治国（1978-），男，教授，博士，研究方向为发酵工程。