杏鲍菇软腐病的病原菌及其生物学特性研究*

药欣荣，常明昌，刘靖宇，赵 慧，仝宗军，常晏民

（山西农业大学食品科学与工程学院，山西 太谷 030801）

〈病虫害防治〉

杏鲍菇软腐病的病原菌及其生物学特性研究*

药欣荣，常明昌，刘靖宇**，赵 慧，仝宗军，常晏民

（山西农业大学食品科学与工程学院，山西 太谷 030801）

软腐病是目前山西省杏鲍菇工厂化生产中发现的新病害。为明确其致病菌，通过染病子实体组织分离获得1株病原菌，经过形态特征观察和16SrDNA基因序列分析，确定该病原菌为芽孢杆菌属细菌（Bacillus sp．），该致病菌对杏鲍菇菌丝、子实体都具有侵染能力。通过对该病原菌生物学特性的研究发现，其最佳生长条件为30℃，pH8，NaCl浓度15 g·L-1。在菌丝培养阶段强化细菌性病害检测，出菇管理中严格控制低温条件，有助于预防软腐病发生。

杏鲍菇；软腐病；病原菌鉴定；生物学特性

杏鲍菇（Pleurotus eryngii）是我国工厂化生产的继白色金针菇之后的第二大食用菌种类[1]。由于我国杏鲍菇生产多采用高密度、封闭、立体式的工厂化生产模式，病害一旦发生，传播速度快，扩散范围广，对企业的正常生产产生较为严重的影响。Smith和Anna等的研究结果表明托拉氏假单胞杆菌（Pseudomonas tolaasii） 可引起褐斑病（Brown Blotch Disease），同时Ro等发现病毒PeSV可造成杏鲍菇病毒性病害[2-4]。

2013年在山西省一些杏鲍菇生产企业发生了1种国内未见过的病害，该病害发生时，在染病子实体的菌柄和菌盖表面，呈现粘稠状腐烂病症，会严重降低杏鲍菇子实体的商品性。为此，本文开展了相应的病原学研究，以期明确该病害的病原菌种类及其生物学特性，为科学防治该病害提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料

杏鲍菇腐烂病子实体与健康子实体，均采自山西省晋城市泽地萃绿农开发有限公司。

1.1.2 培养基和出菇培养料配方

LB液体培养基：蛋白胨10 g、酵母膏5 g、NaCl 10 g，蒸馏水1 L，pH7.4。

PDA培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g，蒸馏水1 L，pH自然。

出菇培养料：棉籽壳77%、麸皮20%，糖、石灰和石膏各1%，pH7，料水比1∶1.5。

1.2 病原菌分离纯化

选取杏鲍菇子实体病斑部位，在超净工作台中切取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的表层组织，用无菌水冲洗3遍，接种于LB培养基中。摇床暗培养24 h（30℃，160 r·min-1） 之后，在无菌条件下，稀释至原始浓度的10-6倍后，取100 μL涂布于直径90 mm的PDA培养基培养皿中，30℃倒置暗培养36 h，挑取单菌落进行保种。

1.3 病原菌致病性分析

1.3.1 子实体侵染

取病原菌菌液对健康杏鲍菇的菌柄和菌盖进行侵染，以无菌水为对照，每个处理3次重复。

1.3.2 菌丝侵染

取健康杏鲍菇菌丝接种于PDA试管培养基中，24℃恒温暗培养4 d后，将病原菌点接于菌丝尖端未生长处，24℃恒温暗培养2 d。直到病原菌被菌丝生长所覆盖，将被侵染的菌丝接种于瓶装出菇培养料中，以健康菌丝为对照，按常规杏鲍菇栽培流程进行出菇试验。

1.4 病原菌的分类鉴定

1.4.1 形态学鉴定

将菌株在LB平板上培养48 h，观察菌落生长特征，并作记录。参照参考文献 [5]进行利用电子显微镜观察菌体形态、大小，并记录。

1.4.2 病原菌菌株16S rDNA基因序列比对鉴定

参考Vanysacker的方法[6]进行基因组DNA提取，采用细菌16S rDNA通用引物27F（5’-GACTCG GTCCTAGTTTGAGA-3’） 和1472R（5’-GGTTAC CTTGTTACGACTT-3’）进行扩增反应，扩增体系和扩增程序参考刘冰花等方法[7]进行，PCR扩增产物经1.7%琼脂糖凝胶电泳检测后送交上海生工生物工程股份有限公司进行测序。测序结果在GenBank中进行BLAST同源性序列比对，并用软件MEGA6.0[8]构建系统发育树对病原菌进行鉴定。

1.5 病原菌生物学特性分析

1.5.1 温度对菌丝体生长的影响

将病原菌稀释后在LB液体培养基中摇床暗培养（160 r·min-1，24 h），温度设置为 10℃、20℃、30℃、35℃、40℃和50℃六个梯度。以未接种的LB液体培养基为对照，用分光光度计测定菌悬液的光密度值（OD600），每个处理3次重复。

1.5.2 pH对菌丝体生长的影响

在无菌条件下，用1mol·L-1的NaOH和1mol·L-1HCl调节LB液体培养基的pH，pH设置为4、6、8、10、12，方法同1.5.1。

1.5.3 NaCl浓度对菌丝体生长的影响

以基础培养基为对照，设置NaCl浓度为0、5 g·L-1、10 g·L-1、15 g·L-1和20 g·L-1，方法同1.5.1。

2 结果与分析

2.1 致病性分析

致病性分析见图1。

图1 致病性分析Fig.1 Pathogenicity test

由图1可知，病原菌菌液侵染杏鲍菇菌柄和菌盖处均出现病症，见图1中的A、a以及B、b，被侵染的菌丝在瓶装出菇培养料中菌丝生长期的菌丝密度明显变稀疏，生长速度明显变慢（见图1中的C、c以及D、d）。经出菇培养后，其子实体发育期菌柄和菌盖处均出现与出菇房相同病症，因此，病原菌侵染量大，导致子实体出现畸形。

2.2 形态学分析

病原菌的形态特征见图2。

图2 病原菌的形态特征Fig．2 Morphological characteristics of pathogenic bacteria

如图2所示，病原菌在LB平板上28℃培养2 d，菌落淡黄色，直径2．5 mm左右，圆形，表面光滑有光泽，平凸，边缘整齐，无粘性，有微弱的臭味。显微观察显示该细菌菌体为两端钝圆的短小杆菌，单独存在或成双，但不呈现长链状排列，革兰氏染色为阴性。

2.3 病原菌16S rDNA鉴定及其系统发育树的构建

基于16S rDNA基因序列同源性病原菌系统发育树见图3。

图3 基于16S rDNA基因序列同源性病原菌系统发育树Fig．3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequence homology of pathogenic bacteria

测序结果显示病原菌16S rDNA扩增片段长度为1 456 bp。将测序结果在GenBank中进行BLAST比对，发现杏鲍菇腐烂病病原菌16S rDNA序列与Bacillus sp．（登录号为GQ495042） 的16S rRNA序列相似程度为99%，病原菌的16S rDNA序列已提交至 GenBank，登录号为 KT426539。利用软件MEGA6．0，以部分Bacillales目菌株为基础构建16S rDNA基因进化树（图3），结果表明该病原菌与芽孢杆菌属细菌有较高的遗传相似性，该菌株与菌株登录号为GQ495042的Bacillus sp．M_17相似性最大，且相似性高达100%。

2.4 病原菌生物学特性分析

2．4．1 最适温度分析

温度对病原菌生长的影响见图4。

由图4可知，病原菌在不同温度下培养1 d后，生长速度存在显著差异，该菌在20℃～50℃均可生长，最适温度为30℃，10℃、20℃病原菌几乎不生长。

2．4．2 最适pH分析

图4 温度对病原菌的影响Fig．4 Effect of temperature on pathogenic bacteria

pH对病原菌生长的影响见图5。

图5 pH对病原菌的影响Fig．5 Effect of pH on pathogenic bacteria

由图5可知，病原菌在不同pH的液体LB培养基中培养1 d后，生长速度差距明显，在pH为6～10的条件下均可生长，最适pH为8，pH为4和12时不利于病原菌生长。

2．4．3 NaCl耐受能力分析

NaCl对病原菌的影响见图6。

图6 NaCl对病原菌的影响Fig．6 Effect of NaCl concentration on pathogenic bacteria

由图6可知，病原菌在NaCl浓度0～20 g·L-1的液体LB培养基中培养1 d后，病原菌均可生长，该菌最适NaCl为15 g·L-1。

3 讨论

2013年关统伟等[12]对杏鲍菇培养料中的细菌多样性进行研究，其研究结果显示鉴定菌株多数属于Bacillus属（36．7%）和Thermus属（28．2%），并推测这些细菌可能会对杏鲍菇人工栽培病害发生构成一定的潜在威胁。本研究通过对该致病菌的分离和鉴定，表明这一新的杏鲍菇软腐病是由1种芽孢杆菌属细菌（Bacillus sp．M_17）引起。对该细菌的致病性测定还显示其对杏鲍菇菌丝具有侵染效果，而对子实体侵染无效果，这与食用菌常见病害，如平菇褐斑病[9]、双孢菇褐斑病[10]和金针菇软腐病[11]等病原菌致病性测定结果不同。同时，我们还发现被Bacillus sp．侵染的杏鲍菇菌丝生长速度明显变慢，密度明显变稀疏，据此推测该病原细菌侵染杏鲍菇菌丝的机制可能与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） S9对真菌立枯丝核菌（Rhizoctonia solani） 菌丝的侵染相似[13]，可吸附于菌丝上，并伴随菌丝生长，而后产生溶菌物质消解菌丝体，从而导致被其侵染的菌丝出现生长速度变慢，长势减退以及杏鲍菇子实体病变。随后的生物学特性实验显示，该病原菌的最适生长条件为温度30℃，pH8，NaCl浓度15 g·L-1。这一研究结果为杏鲍菇菌种生产和出菇管理，采用物理、化学和生物方法综合防控该病原菌的滋生和蔓延，提高杏鲍菇的品质和产量提供了重要参考。

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[2]Smith JF．The mushroom industry[C]//Exploitation of microorgansims．Netherlands:Springer,1993:249-271．

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[4]Anna JW,Elzbieta M,Jacek P,et al．Uptake of cadmium ions in white-rot fungus Trametes versicolor:effect of cd(II)ions on the activity of laccase[J]．Cell Biology International,2002,26 (7):605-623．

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Biological Characteristics of Soft-rot Parasitic on Pleurotus eryngii

YAO Xin-rong,CHANG Ming-chang,LIU Jing-yu,ZHAO Hui,TONG Zong-jun,CHANG Yan-min
(College of Food Science and Engineering,Shanxi Agricultural University,Taigu 030801,China)

A new disease,soft-rot disease,was recently found in Pleurotus eryngii growing factory in Shanxi province．A bacteria isolate was generated from the diseased fruiting body．Pathogenicity test,morphological observation and 16S rDNA sequence analysis had proved that the bacteria was Bacillus sp．,the pathogen of the disease．The pathogen had the ability to infect mycelia of P.eryngii and the fruiting body without infection．The biological test showed that the optimum culture conditions for the pathogen were temperature of 30°C,pH of 8,NaCl concentration of 15 g·L-1．It is helpful to prevent the occurrence of the disease by strengthening the detection of bacterial diseases in the culture of the mycelia and the strict control of the low temperature conditions in mushroom growth．

Pleurotus eryngii;soft-rot;pathogen identification;biological characteristics

S646.1

A

1003-8310（2017）04-0058-05

10．13629/j．cnki．53-1054．2017．04．014

山西省煤基重点科技攻关项目（FT2014-03-01）；国家星火计划项目（S2015A300010）；2015年度山西省高校协同创新中心项目；山西农业大学科技创新基金项目（201315）；山西农业大学大学生科技创新项目（13-044）。

药欣荣（1992-），女，在读硕士研究生，主要研究方向为食用菌病虫害防治。E-mail:yxr096vip＠163．com

**通信作者：刘靖宇（1980-），男，博士，副教授，主要从事食用菌栽培与育种研究。E-mail:liujingyu80＠126．com

2017-05-10