尹 敏,赵迎春,刘雨阳,吴素蕊,赵天瑞,樊 建*
(1.昆明理工大学云南省食品安全研究院,云南 昆明 650500;2.云南省食品药品监督检验研究院,云南 昆明 650106;3.中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所,云南 昆明 650221)
冬虫夏草菌丝体多酚提取及对3种癌细胞抑制作用研究
尹 敏1,赵迎春2,刘雨阳1,吴素蕊3,赵天瑞1,樊 建1*
(1.昆明理工大学云南省食品安全研究院,云南 昆明 650500;2.云南省食品药品监督检验研究院,云南 昆明 650106;3.中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所,云南 昆明 650221)
以冬虫夏草的菌丝体为原料,提取溶剂为乙醇,采用Folin-Ciocalteu法测定冬虫夏草菌丝体中多酚的含量,目的在于研究乙醇浓度、料液比、提取温度和提取时间对多酚提取率的影响。以单因素试验为前提,以正交试验来指导优化提取参数,测定了所得多酚含量及其对Caco-2结肠癌细胞、HepG-2肝癌细胞、MCF-7乳腺癌细胞的抑制作用。研究结果表明,在冬虫夏草菌丝体的提取工艺中,最佳的提取工艺条件为:温度为70℃,提取时间60 min,乙醇的浓度70%,料液比(g∶mL)1∶35;冬虫夏草菌丝体中提取的粗多酚对试验中3种癌细胞都表现出一定的抑制作用,当菌丝体粗多酚的浓度为100 μg·mL-1时,对3种癌细胞抑制率达到最高,分别为72.12%(Caco-2结肠癌细胞)、83.67%(HepG-2肝癌细胞)和58.78%(MCF-7乳腺癌细胞)。
冬虫夏草菌丝体;多酚;癌细胞;抗癌作用
冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis),又名虫草。在适宜的条件下,寄生在高山草甸土壤中蝠蛾幼虫身体里,僵化后形成冬虫夏草菌的子实体,其与僵虫菌形成菌物复合体,即冬虫夏草[1]。它是中国历史上名贵的中药材,主要分布在我国的西藏、四川、云南、青海等高寒地带[2]。据《本草从新》描述,冬虫夏草以四川产的为最佳,云南和贵州次之。研究表明,冬虫夏草中富含多种不饱和脂肪酸、氨基酸、多糖类物质和维生素B12等。现代医学研究表明,冬虫夏草在提高人体免疫力、抗肿瘤活性和抗辐射等方面均具有较好的功效[3]。
冬虫夏草的医学研究价值非常高,程丽芳等[4]研究冬虫夏草内的多糖物质对肝癌SMMC-7721细胞的增殖和抑制作用。孙艳[5]等用不同浓度的冬虫夏草细粉注射到H22肝癌小鼠的腹腔中,观察小鼠的肿瘤抑制率以及NK细胞、T淋巴细胞转化率。刘彦威等[6]研究冬虫夏草菌丝体水提物的抗新城疫病毒作用。本文以冬虫夏草菌丝体为原料,采用乙醇溶剂浸提法提取冬虫夏草中的粗多酚,优化提取工艺条件,确定最佳提取条件,并探究冬虫夏草粗多酚对3种癌细胞的抑制作用。
1.1 试验材料与试剂
供试菌种:冬虫夏草菌种为昆明食用菌研究所保藏菌种;试剂:琼脂、酵母膏、葡萄糖、蛋白胨、Na2CO3、福林酚、没食子酸、KH2PO4、MgSO4·7H2O、乙醇等。
1.2 试验仪器
BSC-250型恒温恒湿培养箱,上海博讯实业有限公司医疗设备厂;QYC-2102C型光照振荡培养箱,宁波江南仪器厂;TU1901型分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;TGL-16G离心机,上海安亭科学仪器厂;ES-315高压灭菌锅,TOMY KOGYO Co.Ltd.;AL204型分析天平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;ZD-F12型真空冷冻干燥机,南京载智自动化设备有限公司;N-1100型旋转蒸发仪,上海爱朗仪器有限公司;SW-CJ-ID超净工作台,苏州净化仪器厂;HH-4恒温水浴锅,金坛科析仪器有限公司;FRD系列多功能薄膜封口机,中国船舶重工集团公司;YHZ82恒温振荡器,常州中国电器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 冬虫夏草菌丝体的制备
液体发酵培养:经活化后的菌种进行液体发酵培养,将带菌的琼脂块置于往复式摇床上培养,培养温度为25℃~27℃,摇床转速为180 r·min-1~200 r·min-1,培养时间为7 d[7]。
冬虫夏草菌丝体制备:发酵培养完成后,去除琼脂块,离心10 min(5 000 r·min-1),得到冬虫夏草菌丝体,用纯水洗涤菌丝体3次~4次,冻干,即得冬虫夏草菌丝体。
1.3.2 冬虫夏草菌丝体多酚提取和含量测定
冬虫夏草菌丝体→粉碎过筛(70目)→水浴提取→过滤→离心(5 000 r·min-1,10 min)→浓缩冻干→多酚粗提物。
用Folin-Ciocalteu法测定冬虫夏草多酚粗提物中多酚含量。以不同条件下的冬虫夏草多酚粗提物为实验原料测定其吸光值,菌丝体多酚得率(P)公式为:
式中:C表示提取液浓度,mg·mL-1;V表示提取液体积,mL;N表示稀释倍数;M表示菌粉质量,g。
1.3.3 单因素试验和正交试验设计
通过研究不同提取温度、乙醇浓度、提取时间和料液比等对多酚得率的影响,选择最佳的试验条件。在单因素试验过程中取得的最佳试验条件的基础之上,再以这四个因素为正交试验的因素,采用L9(34)正交优化表作为试验研究方案,设计3个水平,以冬虫夏草菌丝体中粗多酚的提取率作为参考指标,确定其最佳提取工艺条件。正交试验水平与因素设计见表1。
表1 正交提取试验设计的因素与水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal extraction experiment
1.3.4 冬虫夏草菌丝体多酚类物质对3种癌细胞抑制作用
(1)试验分组
空白组A0:完全培养液90 μL、PBS 10 μL;模型组Ax0:癌细胞悬液90 μL、PBS 10 μL;样品组Ax:癌细胞悬液90 μL、样品10 μL。
96孔板中,每孔加入癌细胞悬液 (1×106个·mL-1) 90 μL,不同浓度多酚提取物稀释液10 μL(终浓度分别为20 μg·mL-1、40 μg·mL-1、60 μg·mL-1、80 μg·mL-1、100 μg·mL-1),空白组和模型组每孔分别用10 μL的PBS补齐,每个浓度组设3个平行。置于37℃,5%CO2培养箱内培养72 h。
(2)细胞抑制率测定
培养72 h后,每孔中加入10 μL的CCK-8试剂(碧云天),置于37℃,5%CO2培养箱内继续培养4 h后,在450 nm处测定每孔的吸光值以计算细胞增殖情况,细胞抑制率(I)公式为:
式中:Ax表示样品组的吸光值;A0表示空白对照组的吸光值;Ax0表示模型组的吸光值。
1.3.5 数据处理
试验数据采用“平均数±标准差”来表示,数据统计及方差分析工作采用Origin软件完成。
2.1 冬虫夏草菌丝体多酚提取
2.1.1 单因素试验结果及分析
(1)乙醇浓度对菌丝体多酚提取率的影响
乙醇浓度对冬虫夏草菌丝体多酚提取率的影响情况见图1。
图1 乙醇浓度对冬虫夏草菌丝体多酚提取率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on the polyphenols extraction rate of Cordyceps sinensis mycelium
由图1可以看出,随着乙醇浓度的提高,冬虫夏草菌丝体中多酚的提取率先上升后下降。且当乙醇浓度从30%升至50%时,多酚提取率提高显著。当乙醇浓度为60%时,多酚提取率达到最大值,为0.945%。随着进一步增大乙醇浓度,多酚提取率缓慢下降。造成多酚提取率下降的原因,一方面可能是由于乙醇的浓度太高,容易挥发从而影响多酚的提取效果。另一方面,乙醇浓度过高,导致冬虫夏草菌丝体内色素和醇溶性成分等的溶出,进而引起多酚提取率的下降。而当乙醇浓度低于60%时,多酚提取率未达到最大值,可能是由于水与菌丝体内的糖类成分相互溶解,从而影响多酚的提取率[8]。试验结果表明,乙醇浓度60%是最佳提取条件之一。
(2)料液比对菌丝体多酚提取率的影响
料液比对冬虫夏草菌丝体多酚提取率的影响情况见图2。
图2 料液比对冬虫夏草菌丝体多酚提取率的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the polyphenols extraction rate of Cordyceps sinensis mycelium
从图2可以看出,菌丝体多酚得率随着料液比的递减呈现出先上升后下降的趋势。当料液比达到1:35时,冬虫夏草菌丝体多酚提取率达到最大值。这可能是因为传质驱动力会随着料液比的降低而增加,因此,随着料液比的降低,传质驱动力随之增加,从而引起多酚的提取率呈现出上升的趋势[9]。而当料液比继续减小时,多酚提取率显著降低。这可能是由于醇溶性杂质浸出率的增加,以及冬虫夏草菌丝体多糖或其他物质的溶出,阻碍菌丝体多酚的提取。因此,料液比1:35是最佳提取条件之一。
(3)提取温度对菌丝体多酚提取率的影响
提取温度对冬虫夏草菌丝体多酚提取率的影响情况见图3。
图3 温度对冬虫夏草菌丝体多酚提取率的影响Fig.3 Effect of temperature on the polyphenols extraction rate of Cordyceps sinensis mycelium
从图3可知,冬虫夏草菌丝体多酚提取率随着提取温度的升高呈现出先上升后下降的趋势。在50℃到 90℃温度范围内,多酚提取率变化范围为0.822%~1.362%,当温度为 80℃时,多酚提取率为1.362%,达到最大值。当温度超过80℃时,多酚提取率下降的原因可能是温度过高改变了其细胞壁的可溶性,同时,也造成提取液粘度下降。因此,多酚的渗透、溶解、扩散速度也随之加快,使得多酚得率有所增加[10]。但是温度过高一些聚合反应和氧化还原反应也会随之发生,同时也造成乙醇挥发加快,从而使得多酚的得率明显急剧降低[11]。试验结果表明,80℃的提取温度是最佳的提取条件之一。
(4)提取时间对菌丝体多酚提取率的影响
由一些研究看出,多酚提取率会随着提取时间的增加而呈现上升的趋势[12]。然而,随着提取时间的增长,部分多酚类物质有可能会发生降解和氧化等反应,从而导致菌丝体多酚类物质分子结构发生改变,见图4。
图4 时间对冬虫夏草菌丝体多酚得率的影响Fig.4 Effect of time on the polyphenols extraction rate of Cordyceps sinensis mycelium
由图4可以看出,当提取时间小于60 min时,菌丝体多酚提取率显著增加,当提取时间达到60 min时,随着提取时间的增加,多酚提取率缓慢下降。因此,提取时间60 min是最佳提取条件之一。
2.1.2 冬虫夏草菌丝体多酚提取工艺的正交试验
在单因素试验的前提下,以冬虫夏草菌丝体中多酚类物质的提取率为考察指标,采用L9(34)正交表研究最佳的提取工艺条件,结果见表2。
表2 正交试验设计结果Tab.2 Results of orthogonal extraction experiment
由表2可以得出,提取温度是冬虫夏草菌丝体多酚类物质提取率的最主要影响条件。其次从主到次的影响因素依次是提取时间、乙醇浓度和料液比。冬虫夏草菌丝体多酚浸提最好的工艺条件为C1D2A3B2,即提取温度70℃,提取时间60 min,乙醇浓度70%,料液比1:35(g:mL)。
2.2 CCK-8法检测细胞存活率分析
冬虫夏草菌丝体中提取的粗多酚对HepG-2肝癌细胞、Caco-2结肠癌细胞和MCF-7乳腺癌细胞的抑制作用分别如图5所示。从图5中可以看出,随着冬虫夏草多酚浓度的提高,3种癌细胞的抑制率有一定上升趋势,呈现较好的正相关性。
图5 粗多酚对3种癌细胞抑制率的影响Fig.5 Effects of crude polyphenols on inhibition of three kinds of cancer cells
由图5可知,冬虫夏草菌丝体中粗多酚类物质对3种癌细胞均产生一定程度的抑制作用,对癌细胞抑制效果,从好到坏排列依次是HepG-2肝癌细胞、Caco-2结肠癌细胞、MCF-7乳腺癌细胞。当粗多酚浓度为100 μg·mL-1时,对Caco-2结肠癌细胞的抑制率为72.12%,MCF-7乳腺癌细胞的抑制率为58.78%。可能是因为冬虫夏草菌丝体中多酚类物质的抗氧化作用可以引起的癌细胞数量减少,多酚中的酚类物质种类和含量也可能会影响到癌细胞的减少程度。Alshatwi等[13]认为茶多酚对宫颈癌细胞有良好的抑制作用,能修复和影响宫颈癌细胞的生长刺激信号和PCD的阻力等。Cai等[14]对不同草药中的多酚含量以及抗氧化活性和抗癌之间的关系进行研究,结果表明多酚类物质能够有效抑制癌细胞的繁殖速度,是主要的抗癌活性成分。
通过正交实验确定了最佳的提取工艺条件:提取温度70℃,提取时间60 min,乙醇浓度70%,料液比是1∶35(g:mL)。在最佳的提取工艺条件下,冬虫夏草菌丝体中多酚类物质提取得率为1.461%。对Caco-2结肠癌细胞、HepG-2肝癌细胞、MCF-7乳腺癌细胞的抑制试验结果表明,冬虫夏草菌丝体中粗多酚类物质对不同癌细胞表现出不同的作用。其对HepG-2肝癌细胞表现出最好的抑制活性,其次依次是Caco-2结肠癌细胞,MCF-7乳腺癌细胞。
[1]Zhu JS,Halpern GM,Jones K.The scientific rediscovery of an ancient Chinese herbal medicine:Cordyceps sinensis:part I [J].Journal of Alternative&Complementary Medicine,1998,4 (3):289-303.
[2]朱印酒,段双全,欧珠朗杰.冬虫夏草的研究进展[J].中央民族大学学报:自然科学版,2009,18(2):27-33.
[3]张志红,杨璐敏,邰丽梅,等.冬虫夏草生理活性成分的研究进展[J].中国食用菌,2014,4(4):1-4.
[4]程丽芳,侯立静,刘瑾,等.冬虫夏草多糖对人肝癌细胞SMMC-7721细胞增殖及凋亡影响的研究[J].中国药理学通报,2015,4(11):114-115.
[5]孙艳,孙艳影,杜凤霞.冬虫夏草精粉抗肿瘤作用的实验研究[J].中华中医药学刊,2007,25(10):2172-2173.
[6]刘彦威,王斌,刘娜,等.冬虫夏草菌丝体水提物的抗新城疫病毒作用[J].河北工程大学学报:自然科学版,2011,28(2):87-90.
[7]孙艳,孙艳影,杜凤霞.冬虫夏草精粉抗肿瘤作用的实验研究[J].中华中医药学刊,2007,25(10):2172-2173.
[8]Teh SS,Niven BE,Bekhit EDA,et al.Optimization of polyphenol extraction and antioxidant activities of extracts from defatted flax seed cake (Linum usitatissimum L.)using microwave-assisted and pulsed electric field (PEF) technologies with response surface methodology[J].Food Science& Biotechnology,2015,24(1649):1649-1659.
[9]赵扬帆.姬松茸酚类物质的提取及其功能学的研究[D].福州:福建农林大学,2008.
[10]李珍.苹果皮渣多酚提取、纯化及抗氧化活性研究[D].北京:中国农业科学院,2014.
[11]李华,王蔚新,袁春龙.葡萄籽多酚提取物的提取工艺研究[J].食品研究与开发,2005,26(6):69-72.
[12]郝少莉,仇农学,王宏.苹果渣中多酚物质的提取技术研究[J].西北农业学报,2006,15(2):152-155.
[13]Alshatwi AA,Periasamy VS,Athinarayanan J,et al.Synergistic anticancer activity of dietary tea polyphenols and bleomycin hydrochloride in human cervical cancer cell:Caspase-dependent and independent apoptotic pathways[J]. Chemico-biological Interactions,2016,247(3):1-10.
[14]Cai Y,Luo Q,Mei S,et al.Antioxidant activity and phenolic compounds of 112 Chinese medicinal plants associated with anticancer[J].Life Sciences,2004,74(17):2157-2184.
Study on Polyphenol Extraction of Cordyceps sinensis Mycelium and Their Inhibitory Effect on Three Kinds of Cancer Cells
YIN Min1,ZHAO Ying-chun2,LIU Yu-yang1,WU Su-rui3,ZHAO Tian-rui1,FAN Jian1
(1.Yunnan Institute of Food Safety,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,China; 2.Yunnan Institute for Food and Drug Control,Kunming 650106,China;3.Kunming Edible Fungi Institute of All-China Federation of Supply and Marketing Cooperatives,Kunming 650221,China)
The polyphenols were extracted from the Cordyceps sinensis mycelium by Folin-Ciocalteu method,with ethanol as extraction solvent extraction.The effect of ethanol concentration,temperature,solid-liquid ratio and time on the extraction efficiency of polyphenols were identified.Based on single factor test,an orthogonal design was applied to optimize extraction process.The polyphenol composition and inhibitory effect of C.sinensis mycelium on three kinds of cancer cells were investigated in the present work.The results showed that the optimum conditions for polyphenols extraction were temperature of 70℃, ethanol concentration of 70%,solid-liquid ratio of 1:35,extracted for 60 min.The polyphenols were extracted from the C. sinensis mycelium have inhibitory effects on three kinds of cancer cells,it showed that the inhibition rate for HepG-2 cell,Caco-2 cell,MCF-7 cell was up to 83.67%,72.12%,58.78%respectively,when the polyphenols concentration was 100 μg·mL-1.
Cordyceps sinensis mycelium;polyphenol;cancer cells;anticancer effect
S646.9
A
1003-8310(2017)04-0048-05
10.13629/j.cnki.53-1054.2017.04.012
尹敏(1992-),女,在读硕士研究生,主要研究方向:食品科学。E-mail:m18468259476@163.com
*通信作者:樊建(1964-),男,硕士,副教授,主要从事食品化学方面研究。E-mail:fanj333@163.com
2017-05-15