核酶的发现及其在基因治疗中的应用

周耕民， 刁勇， 李三暑

(华侨大学 生物医学学院， 福建 泉州 362021)

核酶的发现及其在基因治疗中的应用

周耕民， 刁勇， 李三暑

(华侨大学 生物医学学院， 福建 泉州 362021)

核酶是具有催化功能的结构性RNA分子，且大多数核酶具有剪切RNAs的功能，可以利用它们剪切信使RNA(mRNAs)调节基因表达，从而作为基因治疗的新手段.阐述核酶的发现历程，以及其在艾滋病、肝炎、肿瘤和生殖道系统感染等基因治疗的研究进展.最后，分析核酶在基因治疗中的技术优势及存在问题，并对核酶领域包括更多核酶晶体结构的确立、酶切机理的理解、核酶新的生物学功能的发现等研究进行展望. 关键词： 核酶； 非编码RNA； 基因治疗； 基因表达； 剪切RNA

1 核酶的发现

核酶是具有催化功能的RNA分子[1]，在生物界中执行着非常重要的生物功能，如核糖体RNA(rRNA)和RNase P分别可以合成氨基酸和加工tRNA的前体[2-3].迄今为止，已证实自然发生的核酶种类有14 类.由于大多核酶具有剪切RNA的功能，可利用其对靶标RNA进行切割，从而控制基因的表达.核酶的研究已有30多年的历史.在1980-1990年的10 a间共发现了7类，分别是Group Ⅰ[4]，Group Ⅱ[5]，Rnase P[3]，Hammerhead[6]，Hairpin[7-8]，HDV[9]，Neurospora VS[10]；在1991-2013年的近25 a间仅发现了3 类，分别是GIRI[11]，ribosomal RNA[12]，glmS[13].在2014-2015年的两年间，Breaker实验室发现了4 类自我剪切的核酶，分别是Twister[14]，Twister Sister[15]，Hatchet[15-16]，Pistol[15，17]，并且Steitz实验室和另外几个实验室根据这些发现，确立其中两类核酶的晶体结构[18-19].

大多数核酶具有自我剪切的功能，因此，大多数核酶是通过它们的剪切产物被发现的.如Group Ⅰ内含子就是从26S rRNA前体的“隐藏的剪切”产物中被发现的[4]；Neurospora VS核酶是在线粒体RNA的剪切条带中被发现的[10]；当病毒采用滚环复制策略进行复制时，有的核酶作为病毒RNA的一部分发生剪切，把多聚的病毒RNA剪切成单位长度的病毒个体，因而被观察到[20]，如Hammerhead和Hairpin核酶就是在烟草环斑病毒的卫星RNA(satellite RNA of tobacco ringspot virus)的复制中被观察到的[6-8]；HDV核酶也是在肝病病毒的复制中被发现的[9].另外，glmS核酶是在发现核糖开关的过程中被意外发现的，它既是一个核酶，也是一个核糖开关[13].由此可见，这些发现带有比较大的偶然性，经常是在RNA放射性标记、PAGE胶分离和纯化的过程中通过剪切产物被偶然发现的.

最近，Breaker实验室发现4类自我剪切的核酶[14-17].先是通过生物信息学发现许多结构性的RNA，但由于单从RNA二级结构上很难判断它们是否具有核酶的功能，因此，又结合包括合成、放射性标记、胶分离等生物化学方法检测到核酶.这种方法虽然费时费力，但发现方法显然有很大提高.

2 核酶在基因治疗中的应用

由于核酶具有切割RNA的功能，可以利用它们来切割目标RNA，降低基因的表达.Sarver等[21]把加工过的锤头状核酶的催化链部分与底物部分的HIV-1 GAG RNA相混合，发现这个核酶能切割目标GAG RNA，且在细胞内也能切割.这一实验证明利用核酶来开发抗人类免疫缺陷病毒(HIV)的基因治疗是可行的.此后，核酶已经应用于许多疾病包括艾滋病、肝炎、肿瘤和生殖道系统感染等的基因治疗研究中[21-31].

2.1 核酶在抗艾滋病中的应用

艾滋病又称获得性免疫缺陷综合征，是由于HIV(human immunodeficiency virus)病毒侵入人体并强烈破坏体内的免疫系统，引发各种严重的并发症.在艾滋病的基因治疗研究方面，有针对艾滋病HIV基因的RNA靶标，如Gag[21]，LTR[22]，Pol[23]，Tat[24，32]，Tar[25]，Nef[26]，Env[27，33]；HIV 受体的RNA靶标，如CD4和共受体CCR5[34].虽然靶标不同，但效果都很好，比如靶标Gag mRNA的锤头状核酶不仅可以显著降低Gag mRNA和它编码的p24抗原，还降低了HIV-1 前病毒DNA 100 倍以上[21].

另外，为了提高酶切的效率，有的科学家还构建了靶标同一基因的不同位点的核酶.Bai等[34]构建能够在3个位点切割CCR5 mRNA的三联体核酶，并将它转导至CD34+造血祖细胞中，与未经转导的对照组相比，实验组感染HIV的比率下降70%.在靶标HIV不同基因的核酶中，靶标Tat的锤头状核酶已用于治疗艾滋病的临床一期(10个HIV病人)和二期(74个HIV病人)的实验[35].试验结果表明，核酶在艾滋病的基因治疗方面有良好的应用前景.

2.2 核酶在抗肝炎中的应用

在乙肝(HBV)、丙肝(HCV)的基因治疗研究方面，Welch等[36]用发夹状核酶靶向切割pgRNA(pregenomic RNA)和乙肝表面抗原(HBsAg)RNA，通过逆转录病毒导入Hub7细胞与HBV共表达后，病毒颗粒减少66%～83%；Tan等[37]将加工过的锤头状核酶转导至PLC/PRF5细胞，特异性地抑制了80%的HBsAg的表达.Dai等[38]用锤头状核酶靶标HBV的3个不同靶点，大大降低HBsAg RNA的表达.这3个实验靶标HBsAg RNA，效果都很好，表明用核酶进行乙肝基因治疗是可行的.

贾战生等[39]用锤头状核酶靶向切割丙肝病毒的两个非编码区，发现核酶能抑制报告基因的表达.Ryu等[40]利用group Ⅰ内含子靶向切割HCV的IRES(核糖体内结合位点)RNA，并导入白喉毒素A基因(diphtheria toxin A)，从而使被HCV病毒感染的细胞发生凋亡.张文军等[41-42]、李小英等[43]利用核糖核酸酶P(RNase P)靶标HCV的5′UTR (untranslated region)，可减少HCV RNA约1 000倍.由此说明，用核酶靶标非编码RNA进行丙肝的基因治疗是可行的.

2.3 核酶在抗生殖道系统感染中的应用

据报道，高危人乳头状瘤病毒(HPV)感染与子宫颈癌有密切的联系，超过90%的宫颈癌患者被感染了HPV.因此，防治HPV很可能有助于预防宫颈癌，但到目前为止仍没有治疗HPV的有效方法.利用核酶和寡核苷酸来抑制HPV基因的表达成为治疗HPV的新方法[44]，主要靶标为E6 mRNA和E7 mRNA.Lu等[45]设计针对编码HPV-16 E6与E7转录产物开放阅读框(ORF)的特异性核酶，即Rz110与Rz558，并利用腺相关病毒(AAV)作载体转导至受体细胞，发现靶标RNA水平明显降低.Liu等[46]通过分析HPV-6b和11E1 mRNA的同源序列，设计可同时剪切HPV-6b与11E1 mRNA的通用核酶Rz1198；然后，由体外实验证明Rz1198能够特异性切割靶标mRNA，降低HPV DNA复制所必须的E1蛋白质的表达.

Zheng等[47]、饶智国等[48-49]构建具有特异性靶向HPV-16 E6和E7转录产物的锤头状核酶——Rz170，并将其转染至HPV-16阳性宫颈癌细胞CaSKi.结果表明，E6 mRNA，E7 mRNA和蛋白质的表达显著降低，c-myc和BCL-2蛋白质也表达下调，而p53和Rb蛋白质的表达上调；受体细胞在体外和体内实验中的生长均受抑制，凋亡的比率上升，并增强了对化疗和放疗的敏感度.因此，核酶具有治疗宫颈癌的潜力并可与化疗或放疗进行联合治疗.

2.4 核酶在抗白血病中的应用

慢性骨髓性白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)是一种干细胞来源的白血病，其肿瘤细胞含有费城(Philadelphia)染色体和相关的癌蛋白BCR-ABL1[50].P210蛋白是由BCR-ABL融合基因编码的，具有异常蛋白酪氨酸激酶活性，是造成 CML的重要因素.为了提高酶切效率,Leopold等[51]合成针对BCR-ABL mRNA的多元核酶(multi-unit ribozyme)，并用脂质体或叶酸-聚赖氨酸(folic acid-polylysine)作载体将核酶转染至用BCR-ABL融合基因转化的鼠成髓细胞(32D 细胞).结果表明，该核酶可降低BCR-ABL mRNA达1 000倍.另外，通过优化靶标的结合位点也能提高酶切效率.付辉等[52]用构建靶标文库和逆转录相结合的方法筛选靶标跨膜糖蛋白(glycophorin A，GPA)的最佳mRNA结合位点，并用白血病细胞株K562细胞进行验证，发现最好的结合位点可下调GPA的基因表达90%.

为了提高酶切的特异性，Kuwabara等[53]构建带有能识别目标序列(BCR-ABL mRNA)的感应臂(sensor arms)的新核酶.只有在目标序列存在的情况下，它才能与Mg2+结合形成正确的三维空间结构并具活力.该新核酶Maxizyme不但在体外(invitro)，而且在培养的细胞包括源于病人的带费城染色体的BV173细胞中具有高特异性和酶切活力.Tanabe等[54]进一步将转导了抗BCR-ABL 核酶后的CML细胞接种到NOD/SCID (非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷)小鼠体内，与对照组相比，实验组的小鼠在14周后仍然健康存活.由此可见，Maxizyme可完全抑制CML细胞在小鼠体内的浸润(infiltration).

为了提高转染效率，Soda等[55]利用VSV-假型慢病毒载体(lentiviral vectors)构建针对ELA2型BCR-ABL mRNA的特异性核酶并转染至CML细胞.结果显示，CML细胞中的BCR-ABL mRNA的水平明显降低，细胞凋亡率升高.为了研究核酶在体外净化骨髓的作用，吴勇等[56]设计了抗BCR-ABL基因的核酶，转导至CML和正常骨髓细胞，并检测核酶对原代CML细胞的影响.结果表明，核酶能显著抑制肿瘤生长和原代CML细胞中P210融合蛋白的表达，但不影响正常造血祖细胞的生长.在缓解模型中，核酶抑制了K562细胞的增殖和BCR-ABL mRNA的表达，但不影响ABL mRNA的表达.因此，抗BCR-ABL核酶可用于净化骨髓白血病细胞.

3 核酶在基因治疗中的技术优势及面临的问题

核酶是具有催化功能的RNA分子，大多数具有剪切RNA的功能，在肿瘤和病毒性疾病的基因治疗方面极具应用潜力.它的技术优势有如下4点:1) 核酶能够促使靶基因失活且让其无法恢复，因为mRNA被剪切之后就无法翻译出全长的肽链，而且它的稳定性可能也会降低；2) 核酶能够在体外进行循环使用[57]，核酶剪切mRNA后，可以脱离mRNA并找到下一个目标mRNA；3) 核酶直接剪切目标RNA，而不需要像CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)，siRNA(small interfering RNA)或microRNA (miRNA)那样需要由蛋白酶来剪切目标RNA；4) 常用于基因治疗的核酶如锤头状和发夹状核酶分子量比较小，免疫原性弱[57].

核酶的基因治疗面临的问题主要有如下5点：1) 特异性，核酶的酶链部分即使与靶标没有完全配对也可能发生微弱的非特异性剪切[16]；2) RNA分子在人体内常常不稳定，在受体细胞里容易降解；3) 酶切效率，特别是细胞体内的酶切效率.高水平的酶切效率是降低靶标RNA的关键；4) 可塑性，每一种核酶都有保守的核苷酸，如果保守的核苷酸越多，与之相匹配的靶标序列的可选度就越少，即可塑性小.如锤头状核酶只要靶标的序列含有GUC即可，因此，它的可塑性比较强；5) 载体类型和导入技术[58].

容易构建的、高表达的、稳定性好的、转染效率高的载体，以及高效、安全的细胞导入技术也是核酶基因治疗的关键环节.现在常用的载体有慢病毒载体、腺病毒载体、重组腺病毒载体、腺病毒相关载体(AAV)，而常用的导入技术有脂质体导入技术、电穿孔法、显微注射等.这些方法在核酶基因治疗的应用有待进一步探索和完善.

4 研究展望

核酶作为一类非常独特的RNA分子，在生物界占有重要的生物学地位，如蛋白质的合成是由核酶执行的.然而，核酶发现的步伐比较艰难，在刚开始的10 a里发现了7类，之后的近25 a里仅发现了3 类，而且大多是在偶然的实验中发现的.随着生物科技的发展，Breaker实验室于2014-2015年共发现4 类自我剪切的核酶，大大加快了核酶发现的步伐.这些发现将推进核酶领域的研究进一步深入，包括更多核酶晶体结构的确立、酶切机理的理解和核酶新的生物学功能的发现等.

发现核酶不久，锤头状核酶就被应用于HIV基因治疗的研究.核酶能够促使靶基因失活且让其无法恢复，并能够在体外进行循环使用，这些优势的存在都使核酶被广泛关注.但是核酶的应用技术还没有完全成熟，受到诸多因素的影响，如核酶的可塑性、最佳靶位点的选择、核酶的剪切效率、转染的效率、在受体细胞内的稳定性等.随着更多新核酶的发现、核酶晶体结构的确立、剪切机理的深入了解、转染载体技术的进步、不断发展的阳离子脂质体导入技术和核酶化学修饰技术[59]的提高，核酶的基因治疗研究将不断深入，最终会成为疾病治疗的一个重要手段.

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(责任编辑： 黄仲一 英文审校： 刘源岗)

Discovery of Ribozymes and Their Application in Gene Therapy

ZHOU Gengmin， DIAO Yong， LI Sanshu

(School of Biomedical Sciences， Huaqiao University， Quanzhou 362021， China)

Ribozymes are structured RNA molecules with catalytic activities. Since most ribozymes have the ability to cleave RNAs， they could be used to cleave mRNAs and regulate gene expression， and therefore becoming new tools for gene therapy. This paper describes the discovery history of ribozymes and their applications in the therapy researches of acquired immune deficiency syndrome， hepatitis， tumor， reproductive tract infection and other diseases. Lastly， the paper analyzes the technological advantages and the existing problems of the ribozyme′s application in gene therapy, and looks into the future of researches on the establishment of more crystal structures of new ribozymes， understanding of ribozyme cleavage mechanisms, and the discovery of new biological functions of ribozymes.

ribozyme； non-coding RNA； gene therapy； gene expression； cut RNA

10.11830/ISSN.1000-5013.201704012

2017-03-30

李三暑(1972-)，男，教授，博士，主要从事核酶和核糖开关的研究.E-mail:sanshuli@126.com.

国家自然科学基金资助项目(81271691， 81371669)； 华侨大学高层次人才科研启动项目(Z16Y0015)； 华侨大学研究生科研创新能力培育计划资助项目(1511316013)

Q 7

A

1000-5013(2017)04-0509-06