海参内脏酶解制备海参肽工艺

杨东达， 秦洪， 黄雅燕， 叶 静， 张学勤， 肖美添

(华侨大学 化工学院， 福建 厦门 361021)

海参内脏酶解制备海参肽工艺

杨东达， 秦洪， 黄雅燕， 叶 静， 张学勤， 肖美添

(华侨大学 化工学院， 福建 厦门 361021)

以蛋白水解度和酶解液中海参肽相对分子质量的分布作为指标，考察不同蛋白酶的酶解效果，筛选水解海参内脏的最适合蛋白酶，并通过单因素实验和正交实验优化酶解工艺.实验结果表明：胰蛋白酶的水解效果最佳，可用于水解海参内脏制备海参肽；在底物质量分数为1.0%，加酶量为0.375 1 mkat·g-1，pH值为8.0，酶解温度为37 ℃，水解时间为5 h的最优酶解条件下，海参内脏的水解度可达到48.90%，酶解液中的多肽(2 000～5 000 u)质量分数为52.68%，寡肽(含氨基酸)(≤2 000 u)质量分数为47.25%. 关键词： 海参肽； 海参内脏； 胰蛋白酶； 酶解法； 水解度

海参中的蛋白质是其重要的营养成分，并且含有甘氨酸、谷氨酸、天门冬氨酸等近20种氨基酸，且多为人体必需氨基酸[1].生物代谢实验[2]已经证明，大部分蛋白质是通过多肽形式被人体吸收.海参肽的提取方法主要有水解法和酶解法.但由于水解法主要是利用酸或者碱水解蛋白质，其反应条件剧烈，严重破坏海参肽的结构，而且强酸、强碱容易腐蚀设备，对生产设备要求高，因此，酶解法成为近年来制备海参肽的主要方法.目前，海参肽大多是由海参体壁酶解制得，而海参价格昂贵，提取成本高.我国海参年产量超过14 万t[3],在海参加工过程中，大量的海参内脏被废弃，造成海洋生物资源的极大浪费,这些被废弃的海参内脏是制备海参肽和海参多糖等活性组分的良好原料.据报道,海参内脏中含有丰富的蛋白、多糖、脂肪、皂苷等营养成分[4-5]，具有延缓衰老、增强免疫力、抗肿瘤、抗疲劳、抗凝血等活性[6-7]，但有关海参内脏制备海参肽鲜有报道.因此,本文以海参内脏为原料，采用酶法制备海参肽，以蛋白水解度和酶解液中海参肽相对分子质量分布为指标，筛选合适的蛋白酶，并优化其酶解工艺.

1 实验部分

1.1 材料与仪器

1) 材料.实验的海参内脏均为刺参(Stichopusjaponicas)，产地为福建霞浦；中性蛋白酶(1.667 mkat·g-1)、碱性蛋白酶(3.334 mkat·g-1)、胰蛋白酶(4.167 mkat·g-1)、木瓜蛋白酶(1.667 mkat·g-1)、菠萝蛋白酶(8.335 mkat·g-1)，均购自上海金穗生物科技有限公司；已知相对分子质量(Mr)的标准品：细胞色素C(12 500)，胰蛋白酶抑制剂(6 511.44)，杆菌肽(1 422.69)，Val-Tyr-Val(379.5)，Gly-Tyr(238.2),均购于中国计量科学研究院；乙腈,三氟乙酸，色谱纯；超纯水；其他试剂均为分析纯.

2) 仪器.精密pH计(美国奥豪斯仪器有限公司)，Waters 1515型高效液相色谱仪(美国Waters公司)，TSK凝胶渗透色谱柱(SRT SEC-100，Φ7.8 mm×300 mm，江苏苏州赛分科技有限公司),DK-S12型电热恒温水浴锅(上海森信实验仪器有限公司),UV-1800型紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司),TG6-WS型台式高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)，电子天平(德国赛多利斯科学仪器有限公司).

1.2 实验方法

1.2.2 海参内脏酶解最佳蛋白酶的筛选 准确称取一定量的海参内脏粉于反应器中，加入100 mL的蒸馏水，在不同蛋白酶最适pH值和温度条件下，分别向一定量底物溶液中加入中性蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶和菠萝蛋白酶，加酶量0.200 mkat·g-1，酶解5 h，取出煮沸5 min，冷却，离心(4 000 r·min-1，20 min).取上清液定容至100 mL，测定其可溶性多肽质量分数和水解度，并根据水解度及酶解液中海参肽的相对分子质量分布筛选最适蛋白酶.

1.2.3 最佳蛋白酶单因素酶解实验 以底物质量分数为1.0%、加酶量为0.375 1 mkat·g-1、酶解温度为37 ℃、酶解时间为5 h为单因素实验的基础条件，以水解度为指标，分别考察底物质量分数、加酶量、酶解温度和酶解时间对水解度的影响.

1.2.4 正交试验设计 综合考虑各因素对水解度的影响， 在单因素实验的基础上，选择底物质量分数(A)、酶解温度(B)、酶解时间(C)和加酶量(D)等4个因素，采用L9(34)正交设计对海参内脏酶解条件进行优化.表1为正交试验因素水平表.表1中：w(底物)为底物质量分数；ρ为加酶量；θ为酶解温度；t为酶解时间.

表1 正交试验因素水平表Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.3 分析方法

1.3.1 海参内脏基本质量分数的测定 分别采用GB/T 5009.3-2003中的质量法[8],GB/T 5009.6-2003中的索氏提取法[9],GB/T 5009.4-2010中的马弗炉高温灰化法[10],GB/T 5009.5-2010中的微量凯氏定氮法[11]和GB/T 5009.8-2008中的酸水解[12]测定海参内脏的水分、脂肪、灰分、总蛋白和总糖的质量分数.

1.3.2 可溶性多肽质量分数的测定 采用Folin-酚试剂法[13]测定，取酶解液，定容至100 mL量瓶，取5.0 mL溶液，并加入5.0 mL，质量分数为10%的三氯乙酸溶液，混合振荡，离心(4 000 r·min-1，20 min)；取上清液1.0 mL溶液，加入5.0 mL的福林酚试剂甲液，混匀，于30 ℃下放置10 min；然后，加入0.5 mL福林酚试剂乙液，立即振荡混匀，在30 ℃下保温30 min.以不加标准蛋白试管中的溶液为空白，在650 nm下测定吸光度值(D(650))，代入由牛血清白蛋白为标准品绘制的标准曲线中,即可求得可溶性蛋白的质量分数.

随着武器装备信息化建设和成体系发展的逐步深入，仅使用单一组织或功能的嵌入式仿真训练器很难满足现有武器装备的训练需求。因此，大型武器装备系统通常由不同功能的分布嵌入式装备仿真器通过既定的标准集结互联而成。目前广泛使用的既定标准就是HLA/RTI系统架构标准，如图5所示。

1.3.4 酶解液中海参肽相对分子质量分布的测定 采用高效液相色谱法(HPLC)测定海参肽的相对分子质量分布.参照黄雅燕等[15]的方法并略作改进，即色谱柱为SRTSEC-100，Φ7.8mm×300mm，流动相为乙腈∶水∶三氟乙酸(体积比为20.0∶80.0∶0.1)，检测波长为220nm，流速为0.5mL·min-1，进样量为10μL，柱温为30 ℃.

以不同相对分子质量标准品保留时间Rt为横坐标，以相对分子质量对数lgMr为纵坐标，绘制Rt-lgMr标准曲线，相对分子质量校正的线性回归方程为lgMr=4.97-0.078×Rt，R2=0.995 5.取酶解液适量，经0.22μm微孔滤膜过滤，进行色谱分析，计算相对分子质量，并采用峰面积归一法计算海参肽相对分子质量的分布情况.

1.3.5 数据处理及分析 采用Origin9.0和SPSS17.0 统计软件对实验结果进行处理.

2 实验结果与分析

2.1 海参内脏基本组成

海参内脏基本组成，如表2所示.由表2可知：洗净干燥后的海参内脏中，总蛋白质质量分数最高，占总质量的59.50%，其次为灰分和粗脂肪.因此，海参内脏可以做为制备海参肽良好的蛋白来源.

表2 海参内脏中主要化学成分Tab.2 Main chemical compositions of sea cucumber

2.2 蛋白酶水解海参内脏效果

不同蛋白酶水解海参内脏效果的比较，如表3所示.由表3可知：碱性蛋白酶水解度最大，其次为胰蛋白酶和中性蛋白酶，但3种蛋白酶水解度相差不大，因此，进一步比较海参肽中相对分子质量分布，作为判断酶解效果优劣的指；胰蛋白酶酶解液中寡肽质量分数最高，风味蛋白酶次之.

表3 蛋白酶酶解效果的比较Tab.3 Enzymolysis effect comparison of proteases

图1 胰蛋白酶酶解液的液相色谱图Fig.1 HPLC diagram of trypsin hydrolysate

胰蛋白酶酶解液中多肽和寡肽的相对分子质量分布，如图1所示.由图1可知：相对分子质量≤2 000 u的寡肽(含氨基酸)质量分数为47.25%，而相对分子质量为2 000～5 000 u的多肽质量分数为52.68%.因此，综合考虑海参内脏的水解度及海参肽中相对分子质量分布，选择胰蛋白酶作为最佳水解用酶.

2.3 胰蛋白酶酶解条件的优化

按照酶解工艺，以蛋白水解度为指标，考察底物质量分数、加酶量、酶解温度和酶解时间对水解度的影响，如图2所示.由图2可知：各个因素对酶解过程都有一定程度的影响，经优化，底物质量分数为1.0%，加酶量为0.375 1 mkat·g-1，温度为37 ℃，时间为5 h是胰蛋白酶酶解海参内脏的最佳条件.

(a) 底物质量分数 (b) 加酶量

(c) 酶解温度 (d) 酶解时间图2 酶解条件对水解度的影响Fig.2 Influence of enzymolysis conditions on degree of hydrolysis

2.4 正交试验优化酶解条件

正交试验结果和极差、方差分析表，分别如表4,5所示.由表4可知：各因素对胰蛋白酶水解度的影响的大小顺序为A>D>B>C，即底物质量分数>加酶量>温度>时间.其中，底物质量分数对水解度的影响呈极具统计学意义(P<0.01)，加酶量对水解度的影响呈具有统计学意义(P<0.05)，温度对水解度的影响不具统计学意义，但是考虑到温度是影响酶活的重要因素，因此，温度选择37 ℃.最优条件为A2B2C2D2，即底物质量分数为1.0%，加酶量为0.375 1 mkat·g-1，温度为37 ℃，时间为5 h.

表4 正交试验结果及极差分析Tab.4 Result of orthogonal experiment and analysis of difference

进一步在最优条件下进行验证实验，重复3次，其水解度分别为48.63%，48.90%，49.16%.这说明通过正交试验优化得到的最优实验条件，可以用于海参内脏的酶解制备海参多肽.

表5 正交设计方差分析表Tab.5 Variance analysis of orthogonal experiment

“*”表示具有统计学意义(P<0.05)；“**”表示极具统计学意义(P<0.01)

3 讨论

蛋白质为刺参的主要营养成分，占体壁总质量的70%以上，刺参内脏中蛋白质质量分数亦较高.刘小芳等[16]对乳山刺参体壁和内脏基本营养成分进行了分析，其中，刺参内脏蛋白质质量分数占总质量的34.90%.实验对海参内脏基本组成进行分析发现，蛋白质质量分数最高，占总质量的59.50%，但脂肪质量分数较低，占总质量的7.64%，可见海参内脏是制备高活性海参肽的良好资源.

采用的胰蛋白酶是一种肽链内切酶，能消化溶解变性的蛋白质，它作用于多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧端，是酶解蛋白质中常用的蛋白酶.龚丽芬等[17]采用胰蛋白酶酶解文蛤，并测定了氨基酸质量分数，结果表明胰蛋白酶酶解的文蛤提取液中氨基酸质量分数大于热水提取法的质量分数.王金水等[18]研究了胰蛋白酶水解谷朊粉得到的的酶解产物的抗氧化活性，其还原力为0.81，说明其酶解产物具有较好的抗氧化能力.施文卫等[19]通过胰蛋白酶制备鹰嘴豆活性肽，具有较好的抗氧化活性，所得酶解产物对超氧阴离子自由基的清除率为67.59%.

另外，由于蛋白酶的切割位点不同，采用不同的蛋白酶水解，其水解度存在一定的差异.如周洁静等[20]采用木瓜蛋白酶酶解海参肠制备海参肽，并通过正交实验优化酶解工艺，在最佳水解条件下，水解度达到42.2%.刘程惠等[21]通过胰蛋白酶水解海参，在最佳酶解条件下，其水解度达到32.93%.Yan等[22]以水解度为指标，筛选了多种蛋白酶酶解海参内脏，结果表明，胰蛋白酶酶解效果最佳，水解度达到32.38%.袁坤山等[23]采用复合蛋白酶酶解糙刺参内脏制备海参肽，并通过响应面法优化酶解工艺，在最佳水解条件下，水解度达到49.32%，与文中的水解度相差不大.

现有文献报道中，海参肽的制备一般仅以水解度作为指标评价酶解效果，而海参肽的生物活性与其相对分子质量是息息相关的.相对分子质量在2 000 u以下的寡肽主要是通过食物中的蛋白质经过特定的酶水解获得，食用后可以避免肠道酶的水解消化而直接进入小肠被吸收，提高了胃肠对多肽和氨基酸的吸收速率[2].王静等[24]以海参中蛋白酶使其机体自溶，通过超滤进行分级分离并研究其抗氧化活性，结果发现，相对分子质量在3 000 u以下的海参肽，其抗氧化活性最强.袁坤山等[25]利用木瓜蛋白酶酶解糙刺参内脏，酶解产物的相对分子质量在2 000 u以下的组分占总质量的99.52%，500 u以下的组分所占比例则为80.00%，其Vc抗氧化活性当量值(VcEAC)为44.95 mg·g-1，说明所得糙刺参内脏蛋白酶解物具有较高的抗氧化活性.此外，通过酶法制得的海参肽还具有其余的生物活性.袁文鹏等[26]测定仿刺参肠水解液对小鼠负重游泳试验的影响，结果显示能够明显延长小鼠负重游泳时间，说明仿刺参肠水解液具有显著的抗疲劳活性.

以实验开发的酶解工艺制得的海参内脏酶解液中多肽(2 000～5 000 u)质量分数为52.68%，寡肽(含氨基酸)(≤2 000 u)质量分数为47.25%，提示制备所得的海参肽可能具有多种生物活性，有关海参肽的生物活性与相对分子质量关系有待进一步研究.

文中对海参内脏酶法制备海参肽的工艺条件进行优化，通过单因素和正交试验优化了胰蛋白酶对海参内脏的酶解工艺.其最佳的酶解条件：底物质量分数为1.0%，加酶量为0.375 1 mkat·g-1，温度为37 ℃，酶解时间为5 h，pH值为8.0.在此最优条件下，海参内脏的水解度为48.90%，酶解液中相对分子质量在2 000 u以下的寡肽(含氨基酸)质量分数为47.25%.研究可为实现海参内脏高值化开发利用提供坚实的实验基础，有关海参肽的生物活性有待进一步研究.

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(责任编辑： 陈志贤 英文审校： 刘源岗)

Study on Preparation of Sea Cucumber Peptides by Enzymatic Hydrolysis of Sea Cucumber Viscera

YANG Dongda， QIN Hong， HUANG Yayan，YE Jing， ZHANG Xueqin， XIAO Meitian

(College of Chemical Engineering， Huaqiao University， Xiamen 361021， China)

The degree of hydrolysis and molecular weight distribution of peptides were employed as indicators to investigate the enzymatic hydrolysis effects of different proteases and screen out the suitable protease for the hydrolysation of sea cucumber viscera. Single factor and orthogonal experiments were used to optimize the hydrolysis process. The results showed that trypsin had the best hydrolysis efficacy and could be used for the preparation of sea cucumber peptides from sea cucumber viscera. The optimum hydrolysis conditions were as follows: percentage of substrate quality 1.0%， enzyme dosage 0.375 1 mkat·g-1， pH=8.0， temperature 37 ℃， and enzymolysis time 5 h. The degree of hydrolysis was 48.90% under the optimum hydrolysis conditions. The content of polypeptides (2 000-5 000 u) and oligopeptides (containing amino acid)(≤2 000 u) in the hydrolysate were 52.68% and 47.25% respectively.

sea cucumber peptide； sea cucumber viscera； trypsin； enzymatic hydrolysis method； degree of hydrolysis

10.11830/ISSN.1000-5013.201704016

2017-02-22

肖美添(1968-)，男，教授，博士，主要从事海洋功能产品开发的研究.E-mail:mtxiao@hqu.edu.cn.

福建省海洋高新产业发展专项项目(2013019)； 福建省泉州市科技计划重点项目(2014Z100)

Q 814

A

1000-5013(2017)04-0531-06