芪参龟散对Wistar大鼠α-葡萄糖苷酶抑制作用的实验研究

刘志霞 王兴奎 张艳萍

(河北省唐山车城医院内二科，河北 唐山 064000)

芪参龟散对Wistar大鼠α-葡萄糖苷酶抑制作用的实验研究

刘志霞 王兴奎 张艳萍1

(河北省唐山车城医院内二科，河北 唐山 064000)

目的 观察芪参龟散对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。方法 提取Wistar大鼠小肠内表面黏膜的α-葡萄糖苷酶后行酶活力测定，确定最佳反应体系，将芪参龟散用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解，过滤，并稀释成不同浓度的溶液，再将同浓度的芪参龟散脱色，并稀释成不同浓度的溶液，同时以阿卡波糖片作为对照药物，观察芪参龟散对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。结果 芪参龟散有明显的α-葡萄糖苷酶抑制作用。结论 芪参龟散与阿卡波糖片有相似的降糖作用。

α葡糖苷酶类；动物，实验；中药

随着人们生活水平的不断提高，2型糖尿病患病率越来越高，研发治疗2型糖尿病的药物也越来越多，尤其是控制餐后高血糖的药物研发已成为一个热点[1]。临床中α-葡萄糖苷酶抑制剂药效确切，已成为治疗2型糖尿病的一线药物。但目前α-葡萄糖苷酶抑制剂临床中应用的药物种类较少，且有腹泻、腹胀、排气增加等副作用，部分患者不能耐受。为寻找高效、副作用少的α-葡萄糖苷酶抑制剂，我们从中药复方入手，寻找有效抑制α-葡萄糖苷酶的新药，本研究观察芪参龟散对Wistar大鼠α-葡萄糖苷酶的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 Wistar大鼠2只，无特定病原体级(SPF级)，雄性，体质量平均(250±10) g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，动物合格证号：SCXK京2009-0004，饲养于河北联合大学10 000级屏障环境动物实验室，使用证明编号：MY10DXK07，室温20 ℃，相对湿度45%左右，自由饮水，每日光照12 h。

1.1.2 药品及试剂 阿卡波糖片(杭州中美华东制药有限公司，国药准字H20020202)，芪参龟散(药物组成：炙黄芪50 g，丹参30 g，龟版15 g，山药30 g，女贞子15 g，墨旱莲15 g，白术20 g，陈皮10 g，太子参20 g，金银花20 g。以上10味药混匀，用中药粉碎机粉碎成粉，过孔径为0.1 mm药筛后所得细粉备用)，麦芽糖(分析纯，汕头市光华化学厂有限公司，批号051210)，活性炭粉(分析纯，pH值5.0～7.0)，血糖测定试剂盒(上海科华东菱诊断用品有限公司)，0.9%氯化钠注射液，磷酸盐缓冲液(PBS)。

1.1.3 仪器 高速低温离心机(型号：X-22R，德国BECKMAN公司)，酶标仪(型号：BIO-RAD，上海甘薇生物科技有限公司)、Sartorius电子分析天平(型号：BS224S，德国赛多利斯集团)。

1.2 方法及步骤

1.2.1 α-葡萄糖苷酶液的提取[1]Wistar大鼠2只，在禁食24 h后经脱臼处死，剖腹后取小肠约20 cm，轻轻挤压排出内容物，在冰板上剪开小肠，刮取其内表面黏膜，之后加入2倍量4 ℃的pH 值为6.8的PBS缓冲液，用玻璃匀浆器在冰板上匀浆，于4 ℃、5 000 r/min离心机离心20 min，取上清液即为α-葡萄糖苷酶液，-20 ℃保存备用。

1.2.2 酶活性检测及最佳反应体系的确定

1.2.2.1 酶活性检测[2]反应容积确定为1 mL，取α-葡萄糖苷酶液0.05 mL，加入pH值为6.8的PBS缓冲液0.4 mL中，在温度为37 ℃条件下水浴10 min，加入浓度为0.25 mol/L的麦芽糖溶液0.05 mL中，反应30 min后再加入浓度为0.1 mol/L的碳酸钠(Na2CO3)溶液0.5 mL终止反应。氧化酶法测定葡萄糖含量。在37 ℃、pH值为6.8的条件下，每min水解底物生成1 μmol葡萄糖所需的酶量,规定为1个酶活力单位。

1.2.2.2 最佳反应体系的确定 酶浓度的确定：取浓度为0.25 mol/L的麦芽糖溶液0.05 mL，加入稀释不同倍数(2、4、8倍)的α-葡萄糖苷酶液0.05 mL中，在温度为37 ℃条件下反应20 min，在490 nm波长下测定吸光度值，依据葡萄糖的生成量计算α-葡萄糖苷酶活力。酶反应底物的确定：在1 mL反应体系中，分别加入终浓度为0.125、0.25、0.5 mol/L的麦芽糖溶液，从加入麦芽糖开始反应起,在37 ℃恒温箱中反应，分别于10、20、30 min后，检测葡萄糖含量,于490 nm波长下测定吸光度值,根据葡萄糖的生成量计算α-葡萄糖苷酶活力。

1.3 芪参龟散溶液脱色试验[3]

1.3.1 脱色时间的确定 称取芪参龟散2.5 g放入1 000 mL烧杯中，加PBS缓冲液至500 mL，再放入沸水锅中煮10 min，蒸发的水分用同时间煮的PBS缓冲液补齐，然后将药液抽滤，得到5 mg/mL的溶液放入标准瓶中，晾凉备用。取100 mL配好的溶液放入200 mL烧杯中，然后称取0.5 g活性炭放入烧杯中，搅匀，再放入沸水锅中煮10 min，补齐容量，搅匀，留取样品4 mL放入试管中，同法留取15、20、30、40、60 min样品放入试管中备用。6个试管同时离心4 000 r/min，10 min，然后取上清液，用721型可见分光光度计测吸光度值。

1.3.2 活性炭用量的确定 取0.5 g芪参龟散加PBS缓冲液至100 mL，搅匀，在沸水锅中煮10 min，取出后用同时间煮的PBS缓冲液补齐容量，然后过滤，得到5 mg/mL的溶液,晾凉备用。称取0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 g活性炭分别放入6个烧杯中，然后依次在每个烧杯中加入10 mL配好的浓度为5 mg/mL的芪参龟散溶液，搅匀，然后放入沸水锅中煮，20 min后取出，补齐容量，搅匀，留取4 mL药液备用。然后再煮10 min，补齐容量，搅匀，留取4 mL备用。最后将6个不同活性炭浓度的12个样本，同时离心，取上清液，用721型可见分光光度计测吸光度值。

1.4 芪参龟散溶液及阿卡波糖溶液的制备 称取芪参龟散及阿卡波糖片各4 mg，分别加入PBS缓冲液8 mL，过滤，分别稀释成5×10-5、5×10-4、5×10-3、5×10-2、5×10-1mg/mL浓度的溶液，分装于EP管中，-20 ℃冷冻保存，备用。称取芪参龟散0.5 g加PBS缓冲液至100 mL，得到5 mg/mL溶液，加0.03 g活性炭，脱色20 min后晾凉，留取5 mg/mL浓度的芪参龟散溶液4 mL装于EP管中，并将芪参龟散溶液稀释成5×10-5、5×10-4、5×10-3、5×10-2、5×10-1mg/mL浓度的溶液，分装于EP管中，-20 ℃冷冻保存，备用。

1.5 芪参龟散对α-葡萄糖苷酶抑制作用的检测 首先上述各种溶液各取0.1 mL，加0.3 mL PBS缓冲液，再加入0.05 mL 4倍稀释的α-葡萄糖苷酶液；设对照组只加0.4 mLPBS缓冲液，再加0.05 mL 4倍稀释的α-葡萄糖苷酶液酶液；设空白组只加0.5 mL PBS缓冲液，在37 ℃恒温箱中反应10 min。除空白组不加麦芽糖溶液外，其余各组均加入0.05 mL浓度为0.25 mol/L麦芽糖溶液，于37 ℃恒温箱中反应20 min，再加入0.5 mL浓度为0.1 mol/L的Na2CO3溶液终止反应，空白组不加Na2CO3溶液。在96孔板孔中加入各反应液0.02 mL，再加入0.2 mL等比例稀释的酚酶试剂，每个浓度做6个复孔，同时做葡萄糖标准对照，在37 ℃恒温箱中反应15 min。用酶标仪测定490 nm波长下反应液的吸光度值。抑制率(%)=(对照组反应液吸光度值-样品反应液吸光度值)/(对照组反应液吸光度值-空白组反应液吸光度值)×100%。

1.6 统计学方法 根据反应体系的吸光度值计算受试物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率，吸光度值用6个复孔的均数表示。

2 结 果

2.1 最佳反应体系 首先取0.1 mL待测溶液，加入0.3 mL pH 值为6.8的PBS缓冲液，然后加入0.05 mL 4倍稀释的α-葡萄糖苷酶液,在37 ℃恒温箱中反应10 min，再加入0.05 mL浓度为0.25 mol/L的麦芽糖溶液作为底物，在37 ℃反应条件下反应20 min后加入0.5 mLNa2CO3溶液终止反应为最佳反应体系。

2.2 最佳脱色条件 称取芪参龟散0.5 g，加PBS缓冲液至100 mL，得到5 mg/mL溶液，加0.03 g活性炭，脱色20 min为最佳脱色条件。

2.3 芪参龟散对体外α-葡萄糖苷酶活力的影响 通过芪参龟散对α-葡萄糖苷酶抑制作用的实验研究表明，芪参龟散有明显的α-葡萄糖苷酶抑制作用。见图1。

图1 不同浓度芪参龟散脱色前后及阿卡波糖片α-葡萄糖苷酶抑制率比较

3 讨 论

中医学认为，2型糖尿病属消渴范畴，病变脏腑主要责之肺、脾、肾[4]三脏，病机为肺燥胃热，脾肾亏虚，日久多以气阴两伤、脉络瘀阻为主要病机[4]。基于消渴的病变脏腑及发病机制，组方芪参龟散，由炙黄芪、丹参、龟版、山药、女贞子、墨旱莲、白术、陈皮、太子参、金银花10味中药组成，其中炙黄芪为君，补脾益气；丹参活血通经，祛瘀止痛，龟版、山药滋肾阴，健脾胃，均为臣；炒白术、陈皮、太子参、女贞子、墨旱莲增强益气健脾补肾之效，金银花清热解毒，清宣肺热，均为佐。全方补泻兼施，益气活血，补脾益肾，兼清肺热，起到清上补下的作用。现代药理研究表明，黄芪具有保护心、脑、肝、肾、肺的作用，还有降脂、降糖、减少糖尿病并发症等作用[5]。丹参对消化系统、心血管系统、神经系统均有作用，还有抗凝、抗菌消炎、抗氧化作用[6]。龟版有效成分有抗表皮干细胞凋亡的作用[7-8]。女贞子有免疫调节、保肝、抗动脉粥样硬化、抗衰老的作用[9]。墨旱莲水提物能降低大鼠高同型半胱氨酸血症，调血脂，保护血管内膜[10]，同时对急性心肌缺血再灌注损伤有保护作用[11]，改善老年痴呆模型大鼠空间学习记忆功能[12]，具有抗衰老作用[13]；墨旱莲总黄酮具有清除活性氧自由基作用，可抑制卵磷脂脂质过氧化和DNA氧化损伤[14]。山药具有降糖、降脂、抗氧化、抗肿瘤的药理活性[15]，还可促进肾脏再生修复，延缓衰老[16]。陈皮有明显的肝脏保护和肿瘤抑制作用，还有呼吸系统疾病的防治作用，亦有抗炎、抗氧化、降脂作用[17]。太子参可保护心肌，增强免疫，抗应激，抗氧化，治疗糖尿病[18]。金银花具有消炎、抑菌、抗病毒、止血、养肝护胆的药理作用[19]。芪参龟散通过多途径、多靶点的药理作用，达到控制糖尿病目的。本实验结果表明，芪参龟散有α-葡萄糖苷酶抑制作用，芪参龟散低、中剂量组α-葡萄糖苷酶抑制率随药物浓度的增加而升高，高剂量组α-葡萄糖苷酶抑制率随药物浓度的增加而降低，主要责之于高剂量组药物溶液颜色较深。高剂量组药物溶液经活性炭脱色后其抑制率有所升高，但应用活性炭脱色后芪参龟散的整体抑制率降低，考虑活性炭在脱色的同时也将中药中的一部分有效成分脱走，影响了α-葡萄糖苷酶抑制率的检测结果。

中药复方一般颜色偏深，而颜色深直接影响吸光度值的测定，进而影响到α-葡萄糖苷酶抑制率的测定结果。为减少颜色对抑制率的影响，脱色试验尤为必要。芪参龟散溶液应用活性炭脱色时，脱色20 min和30 min吸光度值均偏小，脱色效果较好；且肉眼观察20 min的脱色液略带黄色，30 min脱色液接近无色。考虑40、60 min随脱色时间的延长，虽颜色更浅，但药物有效成分也被活性炭吸收得更多，因此选20、30 min 2个时间作为下一步脱色时间。吸光度值越小，脱色效果越好。但也要考虑脱色后溶液对α-葡萄糖苷酶的抑制效果。若脱色后药液仍有α-葡萄糖苷酶抑制作用，则达到脱色目的。后经α-葡萄糖苷酶抑制试验证明，芪参龟散溶液脱色30 min后抑制率较20 min明显降低，选定20 min为最佳脱色时间；应用0.03 g活性炭脱色效果较好，且有α-葡萄糖苷酶抑制作用。最终确定5 mg/mL浓度的芪参龟散溶液10 mL，加0.03 g活性炭，脱色20 min为最佳脱色条件。脱色过程中应注意，在抽滤时溶液中不要有沉淀，否则会直接影响活性炭的脱色效果和用量。

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(本文编辑：习 沙)

10.3969/j.issn.1002-2619.2017.06.020

R349.29；R446；R698.2；R-331

A

1002-2619(2017)06-0884-04

刘志霞(1977—)，女，主治医师，硕士。从事中药治疗2型糖尿病、脑血管病临床研究工作。

2016-12-07)

1 河北省迁安市中医医院脑病科，河北 迁安 064000