血清糖链抗原、粘附分子及K-ras基因突变水平在胰腺癌中的表达及其临床意义

宋红林



血清糖链抗原、粘附分子及K-ras基因突变水平在胰腺癌中的表达及其临床意义

宋红林

目的 探讨血清糖链抗原、粘附分子及K-ras基因突变联合检测在胰腺癌诊断中的应用价值，及其在胰腺癌中的表达意义。方法 收集109例胰腺癌患者(Ⅰ期14例、Ⅱ期33例、Ⅲ期39例、Ⅳ期23例；淋巴结转移56例，无淋巴结转移53例)、78例胰腺炎患者和98例健康体检者血清。采用化学发光法检测血清CA50、CA125、CA199、CA242水平，采用双抗夹心法酶联免疫吸附试验法检测ICAM、VCAM、ALCAM、CEACAM水平，采用聚合酶链反应法检测K-ras基因突变情况。结果 胰腺癌组CA50、CA125、CA199、CA242、VCAM、ALCAM、CEACAM水平和K-ras突变率明显高于胰腺炎组和健康对照组(P<0.05)；胰腺炎组VCAM、ALCAM、CEACAM水平明显高于健康对照组(P<0.05)，而胰腺炎组和健康对照组CA50、CA125、CA199、CA242水平和K-ras突变率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。联合检测[logit(P)=0.114×CA199+0.235×CEACAM+0.082×K-ras]对胰腺癌的诊断价值最大，AUC达0.931，显著高于各个指标单独检测，其敏感性和特异性分别达94.5%和86.9%。VCAM、ALCAM、CEACAM水平随胰腺癌分期的增加，水平不断升高(P<0.05)；有淋巴结转移的胰腺癌患者粘附分子VCAM、ALCAM、CEACAM水平均明显高于无淋巴结转移胰腺癌患者(P<0.05)。结论 糖链抗原、粘附分子和K-ras基因突变联合检测能够大大提高胰腺癌的诊断效能，其中粘附分子表达水平与胰腺癌的分期和淋巴结转移密切相关。

糖链抗原；粘附分子；K-ras基因突变；胰腺癌；分期

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1105～1109)

胰腺癌被认为是恶性程度极高的消化道肿瘤之一，近年来随着大量饮酒、吸烟、肥胖以及血脂增高，胰腺癌的发病率也在不断升高，居恶性肿瘤发病率的第7位[1]。据统计，美国2013年约4.5万人患胰腺癌，约3.8万胰腺癌患者死亡，5年生存率低于5%，预后极差[2]。胰腺癌由于在腹膜后位，部位较为隐匿，加之早期无明显临床症状，往往发现时也到晚期，给临床治疗带来了困难[3]。早期发现胰腺癌，有利于及时采取治疗措施，避免胰腺癌的转移[4]。

目前胰腺癌诊断主要通过B超、超声内镜、X线计算机体层成像、磁共振成像等影像学技术，但影像学检查往往需要肿瘤发展到一定体积才能观察到，不利于胰腺癌的早期发现[5]。血清肿瘤标志物是肿瘤分泌或释放到外周血中的一类物质，在肿瘤发展到肉眼可见之前，外周血中往往就达到一定的浓度，有利于肿瘤的早期发现[6]。张宁等[7]观察血清CA199、补体3、补体4、总胆固醇和脂类代谢水平在胰腺癌临床诊断中的应用价值，发现血清CA199、补体3、补体4、总胆固醇和脂类代谢物质ApoE水平明显升高，HDL-C、ApoA以及Lp(a)水平对胰腺癌具有一定的诊断价值；同时发现血清CA199、补体3、HDL-C的联合检测要优于各个指标的单独检测，更有利于胰腺癌的早期发现。近年来学者们发现[8]，糖链抗原、粘附分子与K-ras基因突变与肿瘤的发生发展密切相关，但其在胰腺癌诊断中的价值，尚未见系统报道。为此，本研究对109例胰腺癌患者血清糖链抗原(CA50、CA125、CA199、CA242)、粘附分子[细胞间黏附分子-1(ICAM)、血管细胞间黏附分子-1(VCAM)、活化白细胞细胞黏附分子(ALCAM)、癌胚抗原相关细胞黏附分子(CEACAM)]与K-ras基因突变进行检测，探讨其在胰腺癌诊断以及发展中的价值。

1 材料与方法

1.1 一般资料

2015年5月至2016年5月我院收治的胰腺癌患者109例，均经超声、CT和核磁共振等影像学或组织病理学确诊，其中男性63例，女性46例，年龄29～74岁，平均(56.9±15.4)岁；TNM分期：Ⅰ期14例、Ⅱ期33例、Ⅲ期39例、Ⅳ期23例；淋巴结转移56例，无淋巴结转移53例。同时选择同期我院收治的胰腺炎患者78例，其中男性41例，女性37例，年龄25～72岁，平均(53.2±17.9)岁；健康体检者98例，其中男性58例，女性40例，年龄24～76岁，平均(55.1±18.2)岁。所有受试者均签署知情同意书，该研究方案经医院道德伦理委员会通过。

1.2 方法

所有受试者清晨抽取空腹静脉血3 ml，3000 rpm离心10 min，分离血清。CA50、CA125、CA199、CA242采用化学发光法，仪器和试剂采用罗氏电化学发光分析仪E170及配套试剂进行检测。ICAM、VCAM、ALCAM、CEACAM采用双抗夹心法酶联免疫吸附试验法，仪器采用芬兰Labsystems公司的Muhis-kan MK 3酶标仪，试剂由卡迈舒(上海)生物科技有限公司提供。K-ras基因突变采用聚合酶链反应法，试剂盒由福建厦门艾德有限公司提供，在美国ABI 7300实时荧光定量PCR 仪上检测。

1.3 统计分析

采用统计学软件SPSS 17.0进行分析。CA50、CA125、CA199、CA242、ICAM、VCAM、ALCAM、CEACAM 2组间比较采用t检验；K-ras基因突变率2组间比较采用χ2检验；各指标诊断价值分析采用受试者工作曲线(ROC)，ROC曲线下面积比较采用Z检验；各指标的最优组合采用Logistic回归模型进行拟合，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 糖链抗原、粘附分子和K-ras基因突变在各组间的表达水平

胰腺癌组CA50、CA125、CA199、CA242水平明显高于胰腺炎组和健康对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；而胰腺炎组和健康对照组CA50、CA125、CA199、CA242水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。胰腺癌组VCAM、ALCAM、CEACAM水平明显高于胰腺炎组和健康对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；而胰腺炎组VCAM、ALCAM、CEACAM水平明显高于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。胰腺癌组K-ras突变率(90.8%)明显高于胰腺炎组(23.1%)和健康对照组(23.7%)，差异有统计学意义(P<0.05)；而胰腺炎组和健康对照组K-ras突变率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 糖链抗原、粘附分子和K-ras基因突变对胰腺癌的诊断价值

糖链抗原CA50、CA125、CA199、CA242诊断胰腺癌的AUC均>0.7，其中CA199对胰腺癌诊断的敏感性和特异性最高，分别达78.9%和80.1%。粘附分子VCAM、ALCAM、CEACAM诊断胰腺癌的AUC均>0.8，其中CEACAM对胰腺癌诊断的敏感性和特异性最高，分别达84.4%和71.6%。K-ras基因突变诊断胰腺癌的AUC为0.882，对胰腺癌诊断的敏感性和特异性分别达90.8%和76.7%。联合检测[logit(P)=0.114×CA199+0.235×CEACAM+0.082×K-ras]对胰腺癌的诊断价值最大，AUC达0.931，显著高于各个指标单独检测，其敏感性和特异性分别达94.5%和86.9%。见表2。

2.3 糖链抗原、粘附分子和K-ras基因突变与胰腺癌分期的关系

Ⅲ期、Ⅳ期胰腺癌患者糖链抗原CA50、CA125、CA199、CA242水平明显高于Ⅰ期、Ⅱ期胰腺癌患者，差异有统计学意义(P<0.05)；而Ⅲ期、Ⅳ期胰腺癌患者间以及Ⅰ期、Ⅱ期胰腺癌患者间CA50、CA125、CA199、CA242水平比较(P>0.05)。粘附分子VCAM、ALCAM、CEACAM水平随胰腺癌分期的增加，水平不断升高(P<0.05)。胰腺癌Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期间K-ras突变率分别为92.9%、87.9%、92.3%、91.3%，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表1 糖链抗原及粘附分子在各组间的表达水平

表2 糖链抗原、粘附分子和K-ras基因突变对胰腺癌的诊断价值分析

表3 糖链抗原、粘附分子和K-ras基因突变与胰腺癌分期的关系

2.4 糖链抗原、粘附分子和K-ras基因突变与胰腺癌淋巴结转移的关系

淋巴结转移胰腺癌患者粘附分子VCAM、ALCAM、CEACAM水平均明显高于无淋巴结转移胰腺癌患者，差异有统计学意义(P<0.05)。糖链抗原CA50、CA125、CA199、CA242以及K-ras基因突变率在有、无淋巴结转移组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 糖链抗原、粘附分子和K-ras基因突变与胰腺癌淋巴结转移的关系

3 讨论

胰腺癌是一种病因较为复杂的疾病，发病机制尚不清楚，症状不典型，早期易发生转移，是目前预后最差的恶性肿瘤。胰腺癌在腹腔中毗邻关系复杂，具有较强的侵袭性，早期可侵袭周围神经、腹膜和血管，发生淋巴、血源性的播散转移，一般不易对病变部位进行活检[9]。如果通过血清中肿瘤释放的相关物质在早期对恶性肿瘤做出诊断，将大大提高肿瘤患者的诊断率。糖链抗原是一类传统的肿瘤标志物，被用于多种肿瘤的诊断。CA50是一种唾液酸酯和唾液酸糖蛋白，与致癌基因的活化有关。曹圆圆等[10]研究发现，与良性胰腺疾病患者和健康体检者比较，CA50在胰腺癌患者中水平明显升高，其诊断胰腺癌的 ROC 曲线下面积达0.893，敏感性为91.1%，特异性为70.4%。CA125是一种分子量>200 kD的糖蛋白，对卵巢癌具有较高的诊断价值。CA242是一种唾液酸化的糖类抗原，在正常人中含量极低。张建忠等[11]采用循证医学的方法评估CA242对胰腺癌的诊断价值和诊断效能，通过对2014-12-31之前在PubMed、Embase、Web of science、Cochrane协作网数据库、中国知网、谷歌学术搜索、万方及维普数据库公开发表的文献进行检索发现，CA242诊断胰腺癌的合并灵敏度为71%(95%CI:69%～74%)、合并特异度为87%(95%CI:85%～88%)，ROC曲线下面积为0.8487，提示CA242在诊断胰腺癌方面，漏诊率和误诊率较低,可以作为筛选、诊断胰腺癌和评估预后的实验室指标，值得临床推广。CA19-9是唾液酸化的Lewisa血型抗原，是一种黏蛋白型的糖类蛋白，是目前胰腺癌最常用的传统肿瘤标志物，其在胆、胰恶性肿瘤中具有较好的诊断价值。CA125是一种糖蛋白，在卵巢癌中水平明显升高，近年来发现其在其它肿瘤中水平也存在一定的变化。本研究结果显示，胰腺癌组CA50、CA125、CA199、CA242水平明显高于胰腺炎组和健康对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；而胰腺炎组和健康对照组CA50、CA125、CA199、CA242水平比较，差异无统计学意义。

细胞黏附分子可介导细胞之间的相互作用以及炎症因子迁移，维护血管内皮功能的平衡[12]。最近研究显示[13]，血管内皮功能紊乱能够加重肿瘤患者炎症反应，介导患者免疫功能的紊乱。因此，近年来黏附分子表达水平的变化与肿瘤发生发展密切联系起来。钱剑等[14]探讨胰腺癌患者瘤体及外周血ICAM-1和VCAM-1水平的变化，发现胰腺癌患者瘤体及血清中 ICAM-1 和VCAM-1显著高于急性胰腺炎患者及正常健康人，并且血清中ICAM-1 和 VCAM-1水平与CA199表达显著相关，提示ICAM-1和VCAM-1可能与胰腺癌的发生有相关性，对胰腺癌的早期诊疗具有重要的意义。CEACAM是最近新发现的一种粘附分子，功能复杂，其过表达与细胞的分化、凋亡、迁移侵袭有关，目前被发现在多种肿瘤中表达[15]。张科等[16]探讨胰腺癌组织中癌胚抗原相关黏附分子6的表达对患者免疫功能及预后的影响，发现胰腺癌组织中CEACAM6 的强阳性率达50%，CEACAM6 的高表达与 CD8 和 CD45RO 细胞的阳性率呈负相关，高表达 CEACAM6患者的生存期较短，提示CEACAM与胰腺癌的恶性程度有关，其表达对胰腺癌中的肿瘤浸润 T 细胞具有抑制作用。本研究对胰腺癌患者血清中胰腺癌组VCAM、ALCAM、CEACAM水平明显高于胰腺炎组和健康对照组(P<0.05)。与糖链抗原不同的事，胰腺炎组VCAM、ALCAM、CEACAM水平明显高于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

RAS基因家族包括K-Ras、H-Ras 和 N-Ras 3种基因，是人类肿瘤中发现的第1个突变基因，以K-Ras基因突变频率最高，并且与其它基因突变相比，K-Ras基因突变能够更容易导致肿瘤的发生。K-Ras基因编码的蛋白具有 GTPase 活性，在细胞内发挥调节“开关”的作用，正常情况下使GDP 结合失活和GTP 结合激活处于平衡状态，从而发挥细胞的增殖、凋亡调控[17]。刘香吉等[18]采用突变等位基因特异性扩增检测 31例胰腺癌和 22 例非胰腺癌石蜡包埋组织中 K-ras 基因 12 密码子点突变情况，发现胰腺癌患者 K-ras 基因 12 密码子点突变率为 80.6 %；而非胰腺癌患者 K-ras 基因 12 密码子点突变率为 27.3 %，K-ras 基因突变与其蛋白表达呈正相关。黄剑辉等[19]应用实时荧光定量 PCR 方法检测 83 例胰腺癌组织，97 例胰腺癌外周血，其中 24 例外周血标本和组织标本配对，检测其中K-ras基因突变，比较外周血和组织标本突变一致性，外周血标本中检测出 48 例突变(49.48%)，组织中 59 例突变(71.08%)，两种标本一致性为 81.82%，提示胰腺癌患者外周血与组织 K-ras 基因突变一致性较高，在无法获得组织学标本时可以检测外周血 K-ras 基因状态，为胰腺癌的临床诊疗提供帮助。何琳琳[20]对24例胰腺癌患者外周血K-Ras基因进行检测，发现18例患者K-Ras基因突变为阳性，阳性率为75.0%。本研究发现，胰腺癌组K-ras突变率90.8%，明显高于胰腺炎组和健康对照组，差异有统计学意义。

肿瘤标志物的联合应用有助于避免单个标志物的不足，提高临床诊断效能。本研究中糖链抗原CA50、CA125、CA199、CA242，粘附分子VCAM、ALCAM、CEACAM和K-ras基因突变对胰腺癌均表现出一定的诊断价值；相比较而言，糖链抗原的具有较高的特异性，粘附分子具有较高的敏感性，而K-ras基因突变诊断胰腺癌的AUC为0.882，对胰腺癌诊断的敏感性和特异性分别达90.8%和76.7%，诊断价值最大。本研究采用Logistic回归模型对各个指标进行拟合，最终CA199、CEACAM和K-ras基因突变纳入了最终的公式，发现联合检测对胰腺癌的诊断价值最大，AUC达0.931，显著高于各个指标单独检测，其敏感性和特异性分别达94.5%和86.9%。同时，我们对糖链抗原CA50、CA125、CA199、CA242，粘附分子VCAM、ALCAM、CEACAM以及K-ras基因突变与胰腺癌的分期、淋巴结转移的相关性进行了分析，发现粘附分子VCAM、ALCAM、CEACAM在胰腺癌低分期到高分期中水平不断升高，并且与淋巴结转移密切相关；糖链抗原CA50、CA125、CA199、CA242在各个分期中的变化相对不明显；而K-ras基因突变无法对胰腺癌的分期以及淋巴结转移做出判断。

综上，糖链抗原、粘附分子和K-ras基因突变联合检测能够大大提高胰腺癌的诊断效能，其中粘附分子表达水平与胰腺癌的分期和淋巴结转移密切相关。

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(编辑：甘 艳)

Serum Carbohydrate Antigen,adhesion Molecules and K-ras Gene Mutations Levels in Pancreatic Cancer and Their Clinical Significance

SONGHonglin.AnyangPeople'sHospital,Anyang,455000

Objective To discuss the application of serum carbohydrate antigen,adhesion molecules and K-ras gene mutations levels in pancreatic cancer and their clinical significance.Methods 109 cases of pancreatic cancer patients (Ⅰ stage 14 cases,Ⅱ stage 33 cases,Ⅲ stage 39 cases,Ⅳ stage 23 cases;lymph node metastasis 56 cases,non-lymph node metastasis 53 cases),78 cases of pancreatitis patients and 98 cases of healthy controls were collected.Serum CA50,CA125,CA199,CA242 levels were detected by chemiluminescence method,ICAM,VCAM,ALCAM and CEACAM levels were detected by double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay method,and K-ras gene mutation was detected by polymerase chain reaction method.Results Levels of CA50,CA125,CA199,CA242,VCAM,ALCAM,CEACAM and K-ras mutation in pancreatic cancer were significantly higher than those of pancreatitis group and healthy control group(P<0.05).Levels of VCAM,ALCAM,and CEACAM in pancreatitis group were significantly higher than those of healthy control group(P<0.05).There were no significant difference in CA50,CA125,CA199,CA242 levels and K-ras mutation rates between pancreatitis group and healthy control group(P>0.05).Combination test [logit(P)=0.114×CA199+0.235×CEACAM+0.082×K-ras] had the most diagnostic value for pancreatic cancer,with AUC of 0.931,which was significantly higher than individual indicators tested,and the sensitivity and specificity were 94.5% and 86.9%.Levels of VCAM,ALCAM,CEACAM were increased with stage enhancing of pancreatic cancer(P<0.05);Levels of VCAM,ALCAM,and CEACAM in lymph node metastasis group were significantly higher than those of non-lymph node metastasis group(P<0.05).Conclusion Serum carbohydrate antigen,adhesion molecules and K-ras gene mutations combination detection can greatly improve the diagnostic efficacy of pancreatic cancer,and the expression of adhesion molecules is closely related to the stage and lymph node metastasis of pancreatic cancer.

Carbohydrate antigen;Adhesion molecules;K-ras gene mutations;Pancreatic cancer;Stage

455000 河南省安阳市人民医院

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.07.019

R735.9

A

1001-5930(2017)07-1105-05

2017-02-13

2017-03-27)