TTF-1和SPA表达对早期肺腺癌术后复发预测及预后的判断价值

刘瑞青 李醒亚 曹会存 李 辉 曹广劭 刘建文 吴方明 刘玉岩 刘 健 陈利娟



TTF-1和SPA表达对早期肺腺癌术后复发预测及预后的判断价值

刘瑞青 李醒亚 曹会存 李 辉 曹广劭 刘建文 吴方明 刘玉岩 刘 健 陈利娟

目的 研究术后肺腺癌患者组织中TTF-1和SPA的蛋白表达对其复发的预测价值及预后的影响。方法

收集行手术切除的Ⅰ～Ⅲ期肺腺癌患者112例，采用免疫组化方法检测组织中TTF-1以及SPA的表达。结果 68例患者出现复发，TTF-1阳性和阴性表达患者中位DFS分别为41个月和9个月(P=0.013)，中位OS分别为65.0和23.0个月(P=0.037)，SPA阳性与阴性表达患者中位DFS分别为59.0个月和15.0个月 (P=0.018)，中位OS分别为68.0个月和35.0个月(P=0.058)。结论 早期肺腺癌术后组织中TTF-1和SPA的表达是其复发的有效预测指标，TTF-1阳性表达预后更好。

肺腺癌；甲状腺转录因子；表面活性蛋白A；无疾病进展生存期；生存期

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1048～1051)

甲状腺转录因子(thyroid transcription factor-1,TTF-1)属于核转录因子NKx-2家族成员，在甲状腺、肺和前脑的发育过程中发挥重要作用[1]，目前组织中TTF-1的表达多用于鉴别原发性与转移性肺癌，以及肺腺癌与肺鳞癌。多项研究证明TTF-1的阳性表达是非小细胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC)的有利的预后因子[2-3]。表面活性物质A(surfactant protein-A,SPA)由磷脂和蛋白质组成的复合物，具有降低肺泡表面张力的作用[4]，其基因缺失与肺癌预后相关[5],我们前期研究显示组织中TTF-1的表达能预测EGFR突变[6]，肺腺癌亚型与TTF-1的表达以及EGFR突变密切相关[7]。

NSCLC的发病率和死亡率逐年升高，尽管手术切除能有效提高早期肺癌患者的生存率，但术后复发仍是延长生存期的一大障碍。2012年我们对该批数据进行术后2年的随访，复发人数不到一半，无法计算中位DFS以及OS，目前距离手术近6年时间，再次进行随访，旨在讨论组织中TTF-1、SPA的表达对肺腺癌术后复发的预测价值和预后的影响。

1 材料与方法

1.1 临床资料

收集2010年1月到2011年12月在河南省肿瘤医院行手术切除治疗的肺腺癌患者117例，其中5例不符合入选标准。其中男性61例，女性51例，中位年龄58(38～78)岁，非吸烟65例，吸烟47例，所有患者均按UICC(2009)第七版分期标准，其中Ⅰ期53例，Ⅱ期27例，Ⅲ期32例，肿块最大直径中位值为4 cm(2～10 cm)，接受辅助治疗64例，未接受辅助治疗48例，辅助治疗包括全身化疗、局部放疗以及生物治疗等,复发后接受TKI靶向药物治疗20例。排除标准：①患者取标本前进行化疗或者放疗等抗肿瘤治疗，②术后短时间内因为非肿瘤因素死亡，③术后病理分期为Ⅳ期患者，④术后病理证实为非腺癌。

1.1.1 蝎形探针扩增阻滞突变系统(scorpions amplificiation refractory mutation system,scorpions ARMS)即时荧光PCR检测组织中EGFR状态的方法及判读标准 石蜡组织切取4 μm 厚度的切片5张，提取DNA，检测DNA的浓度和纯度，然后扩增(引物由厦门艾德生物医药科技有限公司合成)，可检测19(Del E746-A750和Del E746-A750)和21(L858R)外显子3个位点突变。PCR反应条件:95 ℃ 5 min,1个循环；95 ℃ 25 s、64 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s，15个循环;93 ℃ 25 s、60 ℃ 35 s、72 ℃ 20 s,26个循环；采用美国Stratagene 公司的Mx3000P 实时荧光定量PCR 仪收集信号。每次反应都设置阳性及阴性对照，反应结束后即时PCR仪自动以扩增曲线的形式输出结果。

1.1.2 免疫组化检测组织中TTF-1和SPA表达的方法以及判读标准 石蜡包埋组织块进行4 μm连续切片，脱蜡，高压修复抗原(40 s)，自然冷却，滴加1∶100稀释的鼠抗人TTF-1单克隆抗体(8G7G3/1)或1∶75的鼠抗人SPA单克隆抗体(PE-10)，4 ℃过夜。室温下恢复40 min，滴加即用型二抗(Kit-5020,MaxVision TM试剂盒(鼠/兔)，DAB(DAB-0031)显色，经PBS液清洗后，苏木精复染，盐酸酒精分化，晾干，封片，在显微镜下观察。以PBS代替一抗作为阴性对照，阳性对照采用福州迈新公司提供的阳性组化切片。一抗、二抗和DAB试剂均购于福州迈新公司。TTF-1和SPA的阳性判读详见参考文献[10]。

1.2 随访

通过门诊、电话或信函进行随访，随访内容包括患者病情、复发时间以及转移部位，末次随访时间为2016年5月20日。1例患者失访，按随访截止日期死亡分析。无病生存期(disease-free survival，DFS)是指手术日至术后第一次随访出现复发证据的生存时间。生存期(overall survival，OS)指从手术日开始至因任何原因导致死亡的时间。

1.3 统计分析

应用SPSS 17.0统计软件进行分析，各因素与复发的关系采用χ2检验；Kaplan-Meier曲线(Log-rank法)比较各因素对DFS对OS的影响，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 术后随访以及复发情况

中位随访时间为44.0个月，1年、3年和5年无疾病进展生存率分别为59.0%、46.0%和35.0%，中位DFS为34.9个月，1年、3年和5年累计生存率分别为77.0%。57.0%43.0%，中位OS为57.7个月。112例早期术后肺腺癌患者中有68(60.7%)例复发，局部复发23例，远处复发45例，包括骨转移17例，脑转移15例，6例出现肾上腺转移，8例肝转移，2例胃转移，12例为两处以上转移。

TTF-1阳性表达患者复发率为57.7%(56/97)，明显低于阴性表达患者[80.0% (12/15)]；SPA阳性患者复发率为54.9%(39/71)，低于阴性表达患者[70.7%(29/41)]；淋巴结阴性患者复发率为47.8%(33/69)，明显低于淋巴结转移阳性患者[81.4%(35/43)]，Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期患者复发率分别为47.2%(25/53)、55.6%(15/27)和87.6%(28/32)。

2.2 术后肺腺癌组织中TTF-1表达对DFS和OS的影响

112例早期肺腺癌患者中TTF-1阳性表达为97例(86.6%)，其中TTF-1阳性表达和阴性表达的Ⅰ～Ⅲ期肺腺癌患者术后中位DFS分别为：41.0个月和9.0个月(P=0.013，图1)。中位OS分别为65.0和23.0个月(P=0.037，图1)；TTF-1阴性表达的I期(IA和IB期共53例)肺腺癌患者术后中位DFS和OS分别为9.0和66个月，阳性表达者中位DFS和OS未出来(P=0.067和P=2.33)，见图2。

2.3 术后肺腺癌组织中SPA表达对DFS的影响

112例肺腺癌患者中SPA阳性表达共71例，占63.4%(71/112)。其中SPA阳性表达与阴性表达Ⅰ～Ⅲ期肺腺患者平均DFS分别为59.0个月和15.0个月 (P=0.018，图3)，中位OS分别为68.0和35.0个月(P=0.058)。

图1 早期肺腺癌DFS和OS的K-M曲线图

图2 Ⅰ期肺腺癌DFS的K-M曲线图

图3 Ⅰ～Ⅲ期肺腺癌DFS K-M曲线图

2.4 其他指标对DFS和OS的影响

Ⅰ期患者53例，其中ⅠA期17例，ⅠB期36例，Ⅱ期27例，其中ⅡA期19例，ⅡB期8例，Ⅲ期32例，ⅢA期28例，ⅢB期4例。Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期中位DFS分别为69.0、23.0和13.0个月(P=0.000，图4)，Ⅰ期中位OS未出来，Ⅱ和Ⅲ期中位OS分别为58.0和24.0个月(P=0.000，图4)。有无淋巴结转移的中位DFS分别为67.0和13.0个月,无淋巴结转移者中位OS未出来，有淋巴结转移中位OS为24个月。此外还对年龄、性别、吸烟史以及肿瘤直径对DFS和OS的影响进行分析，见表1。

表1 肺腺癌临床特征及各项指标对DFS和OS的影响

图4 Ⅰ～Ⅲ期肺腺癌DFS和OS K-M曲线图

3 讨论

该批数据显示TTF-1在早期(Ⅰ～Ⅲ期)肺腺癌中表达率为86.6%，组织中TTF-1阳性表达患者较阴性表达患者复发率低，DFS和OS更长。我们将该批数据53例Ⅰ期单独拿出来研究，发现TTF-1阳性表达在ⅠA和ⅠB中对复发的影响较预后的影响大。以往研究显示组织中TTF-1阳性表达的NSCLC患者生存期或无疾病进展期更长[2-3]。关于TTF-1的表达与NSCLC的生存期的关系的机制尚不十分清楚，基础研究显示TTF-1的转录靶向因子肌球蛋白结合蛋白(myosin binding protein H，MYBHP)能抑制ROCK1(physical interaction with Rho kinase 1)并且负向调节肌动球蛋白的结构，减少单个细胞的游动，增加集体细胞的迁移，最终导致减少细胞的侵袭力和转移[8]。中国有学者研究发现非小细胞肺癌中TTF-1的表达能抑制Ki-67的表达并且诱导凋亡。临床研究显示早期NSCLC患者中TTF-1阳性表达是1个独立预后因子[9]。并且我们前期研究发现组织中TTF-1的表达能预测EGFR突变状态[6]，是否EGFR突变情况也影响复发和预后有待进一步研究。也有文献显示亚裔人群TTF-1的表达率高于西方人群的表达，这与亚裔人群EGFR突变率高相吻合。从基础到临床均显示组织中TTF-1阳性表达是NSCLC有利预后因子。我们对一批早期肺腺癌患者进行随访发现，TTF-1阳性表达的确有更好的预后，而且有更好的DFS，但同时发现，阴性表达复发率更高，从而提示组织中TTF-1阴性表达预测复发。

SPA是肺呼吸上皮细胞分泌的1种糖蛋白，调节肺表面活性物质功能的正常发挥，在维持肺功能发挥重要作用，该批数据中显示SPA在肺腺癌中表达率为63.4%，阳性表达患者DFS优于阴性患者。我们前期研究也提示SPA阳性表达预测EGFR突变，但没有TTF-1与EGFR突变关系密切。有文献报道，肺腺癌中SPA基因缺失与吸烟史以及肿瘤进展密切相关，是肺癌不良的预后因子[5]。可能因为SPA的表达对肺功能的影响较大，它参与局部炎症和免疫反应，异常改变将导致许多肺部疾病，如果SPA缺乏，可能会影响肺腺癌患者的肺功能，进而出现SPA阴性表达的术后Ⅰ～Ⅲ期肺腺癌患者DFS较差。

目前临床上TTF-1作为病理中区分肺原发性和转移癌、肺腺癌与肺鳞癌1个常用的免疫组化指标，根据以往文献以及我们本次研究均提示TTF-1的表达预测复发，影响预后，我们能否将TTF-1阴性作为1种亚型特殊对待，或把TTF-1阴性表达作为1个高危因素，即使期别较早，也给与干预，如辅助化疗，减少复发发生，提高生存期。但我们这批数据中17例ⅠA期患者TTF-1均为阳性表达，可能主要影响ⅠB期的复发情况。也许样本量太少的缘故，这也是本研究的缺点。此外该研究还有缺点，我们分析组织中TTF-1和SPA的表达，与基因扩增相比，可能敏感度比较低。

除了组织中TTF-1和SPA与DFS和OS的关系，我们也分析了性别、年龄、吸烟史、淋巴结转移状态、肿块大小以及TNM分期对复发以及预后的影响，发现淋巴结转移状态、肿块大小以及TNM分期对以上两者影响差异显著，再次证实了分期预测复发和判断预后的地位。

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[6] 刘瑞青，申淑景，马 杰，等.肺腺癌组织中TTF-1和SPA的表达对EGFR突变的临床预测价值〔J〕.第三军医大学学报，2012，34(22)：2314-2317.

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(编辑：吴小红)

The Predictive Value of the Expressions of TTF-1 and SPA Protein on the Recurrence and Prognosis of Lung Adenocarinoma after Surgery

LIURuiqing,LIXingya,CAOHuicun,etal.TheAffiliatedPeople'sHospitalofZhengzhouUniversity/HenanPeople'sHospital,Zhengzhou,450000

Objective To study the predictive value of the expressions of TTF-1 and SPA protein on the recurrence and prognosis of lung adenocarinoma after surgery.Methods 112 cases of stage Ⅰ～Ⅲ lung adenocarcinoma were selected.The expressions of TTF-1 and SPA protein in tissues were detected by immunohistochemical detection.Results 68 cases had recurrence,median DFS of patients with positive and negative expression of TTF-1 were respectively 41 months and 9 months (P=0.013),the median OS were 65.0 months and 23.0 months respectively (P=0.037),median DFS of patients with positive and negative expression of SPA were respectively 59.0 months and 15.0 months (P=0.018),the median and OS were respectively 68.0 and 35.0 months (P=0.058).Conclusion The expression of TTF-1 and SPA in postoperative lung adenocarcinoma are effective predictors of recurrence.The patients with positive expression of TTF-1 have better prognosis.

Lung adenocarinoma;TTF-1;SPA;DFS;OS

国家自然科学基金(编号：21504082)

450000 郑州大学附属人民医院，河南省人民医院(刘瑞青，曹会存，李 辉，曹广劭，刘建文，吴方明，刘玉岩，刘 健)；450000 郑州大学第一附属医院(李醒亚)；450000 河南省肿瘤医院(陈利娟)

刘 健

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.07.002

R734.2

A

1001-5930(2017)07-1048-04

2016-08-19

2017-04-20)