易普利姆玛对Lewis肺癌小鼠体内PTHrP表达的影响及与癌细胞衰老的关系

刘雯雯 方宁远



易普利姆玛对Lewis肺癌小鼠体内PTHrP表达的影响及与癌细胞衰老的关系

刘雯雯 方宁远

目的 建立Lewis肺癌小鼠模型，观察Ipilimumab对荷瘤小鼠体内PTHrP及MCT1表达的影响并探讨与癌细胞衰老的关系。方法 取C57BL/6小鼠共30只，建立Lewis肺癌小鼠模型，随机分为对照组、低剂量处理组、高剂量处理组，每组10只。开始给药，给药剂量与方法：低浓度Ipilimumab处理组3 mg/kg，高浓度Ipilimumab处理组 5 mg/kg，共给药5次，对照组给予等量生理盐水。采用免疫组织化学法检测3组中PTHrP、MCT1的表达。结果 3组动物细胞PTHrP蛋白的分泌及MCT1的阳性表达率高度一致，且随Ipilimumab浓度的增高而增高，第3组表达水平较第2组和第1组明显升高，有统计学意义(P<0.05)，第2组表达水平较第1组明显升高，有统计学意义(P<0.05)。且2个指标阳性表达率均与细胞衰老相关基因βGal的表达呈显著负相关性(P<0.05)。结论 Ipilimumab处理后的荷瘤小鼠通过上调PTHrP、MCT1的表达，延缓癌细胞的衰老，最终引起癌细胞侵袭或转移。

肺癌；易普利姆玛；甲状旁腺激素相关蛋白；单羧酸转运蛋白1；细胞衰老

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1052～1055)

Ipilimumab是1种单克隆抗体，是新型的T细胞增强剂及免疫系统激活剂。本研究主要采用免疫组化法对不同剂量Ipilimumab处理的3组动物细胞进行PTHrP、MCT1检测，探讨其在肺癌中表达的相关性及与癌细胞衰老的关系。

1 材料与方法

1.1 动物及细胞株

实验动物为近交系C57BL/6小鼠，雄性，体质量16～18 g，清洁级，购于上海实验动物中心，饲养于上海交通大学实验动物中心，室温20 ℃，湿度 (60%±5%)，饲料及垫料均经消毒处理。实验前小鼠适应环境饲养1周。Lewis肺腺癌细胞株(LLC，为C57BL/6小鼠源性肺腺癌细胞)购自上海中科院细胞生物研究所。瘤细胞培养于高糖完全培养液中。Ipilimumab购于香港华特药房，厂家百时美施贵宝公司。即用型快速免疫组化MaxVisionTM检测试剂盒购于福州迈新生物技术开发有限公司。细胞衰老β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色试剂盒购自北京碧云天公司。

1.2 实验分组及动物肿瘤模型的建立

无菌条件下对2只C57BL/6小鼠进行右侧腋下皮下注射细胞悬液0.2 ml(Lewis肺腺癌细胞株)，注意观察小鼠生长状况。接种10天后，脱颈处死Lewis肺癌小鼠，放入75%酒精浸泡消毒10min，在超净台上分离瘤体，用生理盐水洗净后剪碎，研磨，染色，计算活细胞数>95%，调整肿瘤细胞悬液浓度为1×107/m1瘤细胞，继续皮下接种5只小鼠，每只接种0.2 ml，饲养于SPF级环境，如此皮下接种2次后接种30只小鼠。皮下接种后14天，可以触及皮下直径约10 mm肿块，随机分为对照组、低剂量处理组、高剂量处理组，每组10只。开始给药，给药剂量与方法：低浓度Ipilimumab处理组3 mg/kg，高浓度Ipilimumab处理组5 mg/kg，共给药5次，对照组给予等量生理盐水。

1.3 PTHrP、MCT1、βGal的检测

标本经固定、脱水、包埋、切片、染色，按即用型快速免疫组化MaxVisionTM试剂盒说明步骤操作检测MCT1、PTHrP 表达。标本用PBS漂洗2次，室温下固定，加入X-Gal染色液，调节pH为6.0，孵育48 h，镜下观察，阳性物质为蓝色沉淀，采用Image.ProPlus图文分析系统，随机选取100个细胞，测定每个细胞中阳性着色面积与该细胞总面积的百分比，取其均值作为 SA-β-Gal 阳性表达结果。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 PTHrP、MCT1组织化学检测结果

3组动物细胞PTHrP、MCT1的阳性表达趋势一致，且随Ipilimumab浓度增高而增强(表1)：第3组表达水平较第2组和第1组明显升高，有统计学意义(P<0.05)；第2组表达水平较第1组明显升高，有统计学意义(P<0.05)，且两者阳性表达情况呈显著正相关(相关系数0.486,双侧显著性P=0.006<0.01)。

2.2 βGal组织化学检测结果

βGal作为细胞衰老的常用指标，会随着细胞的老化而表达增强。从蛋白水平检测了βGal的变化，以验证3组细胞的衰老情况，结果发现：与第1组相比，第2组和第3组细胞中两种蛋白的表达水平明显下降(P<0.05)，且第3组两种蛋白的表达水平明显低于第2组(P<0.05) (表2)。PTHrP、MCT1的阳性表达情况与βGal的阳性表达情况呈显著负相关(P<0.01)。

表1 3组细胞 PTHrP、MCT1、βGal 表达情况

表2 细胞 PTHrP、MCT1、βGal 表达三组组间比较( LSD 检测)

3 讨论

易普利姆玛(Ipilimumab)是1种细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)的抑制剂，与CTLA-4特异性的结合，上调T淋巴细胞活化增殖[1]，渗入肿瘤中发挥抗癌作用。2011年美国食品药品管理局年批准了Ipilimumab用于恶性黑色素瘤的免疫治疗。临床治疗中，Ipilimumab单独或联合其他药物在治疗恶性黑色素瘤方面均取得了较好疗效[2]，近年来Ipilimumab治疗肺癌取得良好疗效的研究也有报道[3]。Ipilimumab治疗肺癌的推荐剂量也经历了诸多实验验证[4]，在我们的实验选取的处理剂量为3 mg·kg-1、5 mg·kg-1。Ipilimumab通过活化免疫系统杀伤肿瘤细胞，故不可避免地引起免疫相关性不良反应，近期研究[5]发现接收Ipilumumab治疗的转移性黑色素瘤患者可出现副肿瘤综合征及恶病质相关，其机制不明。

细胞衰老是机体中常见生物学现象，是指细胞脱离细胞周期丧失增殖能力后进入的1种相对稳定的状态，是正常细胞的必然归宿。研究表明肿瘤细胞具有衰老障碍而表现出无限增殖的能力，这也就是机体出现恶病质的原因。肿瘤细胞生长在1种缺氧的环境中，上调糖酵解和适应酸中毒是肿瘤由原位癌转变为侵袭性癌的关键因素。MCT1是单羧酸转运泵家族(MCTs)家族中一员，主要存在于多种肿瘤细胞中，参与乳酸的跨膜转运，加速肿瘤细胞的代谢，调节肿瘤细胞的凋亡。研究证实[6]晚期肿瘤可高表达MCT1，但对于肺癌的相关研究比较少。PTHrP作为1种分泌蛋白，可调节细胞生长周期，改变癌细胞的增殖率、调节凋亡倾向，改变肿瘤的侵袭、转移[7]、影响肺癌症患者的生存率[8]。

PTHrP、MCT1指标均可调节肿瘤细胞衰老逃逸，参与肿瘤细胞侵袭，Ipilumumab治疗后病人也会出现恶病质状态，那么Ipilumumab、PTHrP、MCT1 3者关系如何？该研究主要采用免疫组化法对3组经不同剂量Ipilumumab处理后的动物细胞进行PTHrP、MCT1检测，探讨其在肺癌中表达的相关性及与细胞衰老的关系。

细胞经历DNA损伤、端粒功能下降、癌基因激活后首先出现细胞衰老，细胞衰老便成为抑制正常细胞发生恶性转化的关键条件，这可对抗细胞的无限增生而对机体起到保护作用。细胞绕过衰老途径是其永生化及癌变的必要条件。衰老逃逸参与肿瘤恶化、发展，并成为今后预测肿瘤侵袭转移的因素之一。细胞衰老存在多种标志物，现在应用最广、特异性比较高的为β-半乳糖苷酶[9]。之前研究表明肿瘤细胞在发生远处转移后可大量分泌PTHrP，而衰老相关指标β-Gal表达明显下降，表明肿瘤细胞发生了衰老逃逸，那么PTHrP和肿瘤细胞衰老逃逸之间关系如何，PTHrP是通过什么途径引起肿瘤细胞衰老逃逸的呢？PTHrP是一种分泌蛋白，在胎儿及成人的肺组织及肺癌组织中都有表达，在肺的发育、肺的生理功能、肺损伤及肺癌细胞的侵袭性上均有重要作用。研究表明PTHrP通过影响细胞生长周期而改变癌细胞的增殖率、调节凋亡、阻止肿瘤血管生成等，从而调节肿瘤的进展、肿瘤的侵袭、转移、改变肿瘤对治疗的敏感性，并在不同方面影响肿瘤的病理发生，影响肺癌患者的生存率。大多研究提示在肺癌中PTHrP的表达是1个有益的预后因子，如Hastings 等观察两株肺腺癌细胞株，转染PTHrP 后肺癌细胞的DNA合成受抑制，肺癌细胞的增殖率下降，肺癌细胞的生长速度减慢。Yamada[10]和Bhatia[11]也分别在实验中用抗PTHrP抗体治疗肿瘤患者，均降低了骨转移的发生率，并增加了肿瘤细胞的凋亡。但也有研究显示PTHrP的过度表达可能与机体的恶病质状态有关。早在 2000 年就有研究指出PTHrP 的表达与细胞的恶性转化有关，PTHrP、P53可能在肿瘤的发生发展过程中共同发挥作用。2012年王小虎等人的研究也指出胃腺癌组织高表达PTHrP，中低分化组织表达阳性率较高[12]。近期多项研究表明PTHrP能促进乳腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌的浸润和转移[13]，亦是骨溶解最重要的调节因子之一。 肿瘤细胞是生长在相对低氧的环境中，增加糖酵解、适应酸中毒是肿瘤由原位癌转变为侵袭性癌的必备条件。糖酵解越旺盛，肿瘤细胞生长越快、侵袭性越强，往往迅速复发，预后更差。MCT1表达予肿瘤细胞膜，负责将乳酸转运出细胞，加速糖酵解过程，延缓肿瘤细胞衰老，增加肿瘤细胞侵袭。在我们的实验中观察到经高剂量Ipilumumab处理后的肿瘤细胞，β-Gal表达明显下降，表明细胞衰老被抑制，肿瘤细胞大量繁殖，而这一过程有PTHrP分泌的逐渐增多，同时伴随MCT1表达的明显升高，且两者升高具有显著的正相关性。从中我们猜测高剂量Ipilumumab处理后的肿瘤细胞分泌大量PTHrP蛋白，通过MCT1途径，提高肿瘤细胞的高代谢，促进肿瘤细胞的增殖、分化等，从而有效的抑制其衰老，最终从原位癌转变成浸润癌，使机体最终成为恶病质状态。 在肿瘤高发的当今，免疫治疗为晚期肿瘤患者带来了新的希望，但免疫治疗尚缺乏相应的分子标记来筛选最佳适用患者，同时,目前临床研究发现免疫治疗的近期毒性较小,但其远期毒性仍未可知，如在我们的动物试验中就发现Ipilumumab处理后肿瘤细胞处于衰老逃逸状态，机体最终成为恶病质状态。但我们的实验有一定局限性，如样本数量少，仅限于动物实验。

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(编辑：吴小红)

Effect of Lpilimumab on the Expression of PTHrP in Lewis Lung Cancer Mice and Its Relationship with the Aging of Cancer Cells

LIUWenwen，FANGNingyuan.RenjiHospitalAffiliatedtoShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine，Shanghai,200127

Objective To establish Lewis lung cancer mice model,and observe the effect of ipilimumab on PTHrP and MCT1 in tumor bearing mice and its relationship with cancer cell senescence.Methods A total of 30 Lewis mice which was established Lewis lung cancer mice model were divided into the control group,low dose treatment group and high dose treatment group,and each group with 10 cases.Start to give medicine,dosage and methods:low concentration ipilimumab treatment group 3mg/kg,high concentration ipilimumab treatment group 5mg/kg,a total of 5 times,the control group to give the same amount of normal saline.The expression of PTHrP and MCT1 in the 3 groups was detected by immunohistochemistry.Results The positive expression of PTHrP protein secretion and MCT1 in the 3 groups of animal cells rate highly consistent and tend to increase with the increasing of the concentration of ipilimumab,2 indicators in expression in group 3 than in group 2 and group 1 expression increased significantly,there had statistical difference (P<0.05);in group 2 expression than in the group 1 expression was significantly increased,there had statistical difference (P<0.05).And the positive expression rate of the 2 indicators were significantly negative correlated with the expression of cell senescence associated gene Gal,and the results were statistically significant (P<0.05).Conclusion Ipilimumab treatment of tumor bearing mice by up regulation of MCT1,PTHrP expression,delay the aging of cancer cells,and eventually cause cancer cell invasion or metastasis.

Lung cancer;Lpilimumab;PTHrP;Single carboxylic acid transporter 1;Cell senescence

200025 上海交通大学医学院附属仁济医院

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.07.003

R734.2

A

1001-5930(2017)07-1052-04

2016-08-19

2017-04-20)