血清miRNA-200b在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义

朱利群 王 纯 陈菊香



血清miRNA-200b在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义

朱利群 王 纯 陈菊香

目的 探究血清miRNA-200b在非小细胞肺癌(NSCLC)患者中的表达水平。方法 选择45例NSCLC患者为观察组，同时选取30例经诊断无肿瘤疾病的健康对照组。qRT-PCR检测各组血清miRNA-200b的表达水平。结果

观察组患者miRNA-200b血清表达水平明显高于对照组(P<0.0001)。观察组患者血清miRNA-200b水平随着临床分期的升高而显著上升(P<0.05)；另外，NSCLC患者中肺鳞癌患者血清miRNA-200b表达显著高于腺癌(P<0.0001)。此外，ROC分析miRNA-200b诊断NSCLC最佳cutoff值为0.276(敏感性46.7%，特异性93.3%，AUC值0.779)。结论 NSCLC患者血清miRNA-200b水平显著升高，在NSCLC患者的疾病发展过程中起到重要的作用，可作为无创早期诊断NSCLC的指标之一。

miRNA-200b；非小细胞肺癌；血清

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1059～1061)

肺癌已成为全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，包括中国在内的世界各地每年因肺癌死亡的人数在150万左右[1-3]。肺癌按病理主要分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，后者占据所有肺癌患者的80%以上[4-5]。尽管近年来非小细胞肺癌的治疗效果有较大的提高，最低的5年生存率在15%左右，延误治疗的首选已从手术替换为靶向药物[6-7]。目前，肺癌患者的早期诊断大多采用低剂量的CT，但其具有较高的假阳性率、过度诊断以及潜在辐射暴露危害等局限性。因此，非侵入性的肿瘤标志物的发现与检测将有助于早期肺癌患者的诊断，且能够明显减少患者的死亡率[8]。miRNA是参与转录后调控的非编码小RNA，通过结合mRNA的3’非编码区调控基因的表达。miRNA可由细胞分泌至血液中，也可在其死亡后释放[9-10]。已有研究显示，癌症患者外周血miRNA表达出现异常，且不同恶性肿瘤的miRNA表达不同。miRNA可作为癌基因或抑癌基因参与各种疾病过程[11]。因此，血液miRNA可作为恶性肿瘤确诊的生物标志物，由于其属于无创检验，且特异性良好，已越来越受到临床的推崇。本研究将对非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者血清2种miRNA进行检测，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 临床资料

选择2014年2月至2015年9月在本院肿瘤科就诊的NSCLC患者45例为观察组，其中男性34例，女性11例，年龄为45～76岁，平均年龄(61.3±18.6)岁，吸烟患者为39例。所有患者均经病理检查证实为NSCLC，包括29例腺癌和16例肺鳞癌，其中Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期患者分别为27、11和7例，且患者均无放化疗史及相关免疫治疗史。同时选取30例经诊断无肿瘤疾病的健康对照组，男性22例，女性8例，年龄为32～69岁，平均年龄(58.3±17.7)岁，吸烟患者为25例。一般指标无显著性差异(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取 所有患者均采集静脉EDTA抗凝血5 mL，对全血总RNA提取采用QIAGEN miRNAeasy Mini kit试剂盒进行抽提。Nanodrop 2000(Thermo公司)检测RNA浓度，且OD260/280值在1.8～2.2之间为合格样本。

1.2.2 RNA逆转录为cDNA 采用ABI公司生产的TaqMan miRNA逆转录试剂盒将各组织样本总RNA通过逆转录-聚合酶联反应(RT-PCR)反转录为cDNA，总体系为15 μl。PCR程序为16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。PCR结束后获得的cDNA均保存于-20 ℃冰箱。

1.2.3 qRT-PCR 首先从miRBase数据库中查出miR-200b的序列，随后ABI公司定制合成Taqman荧光探针，通过ABI公司的Step One荧光定量PCR仪对miRNA-200b和内参U6snRNA进行QPCR检测，所有入组标本均重复3个复孔。实时定量PCR反应条件如下：95 ℃预变性3 min，然后以95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min进行40 个循环。miRNA的相对表达水平为2-ΔΔCT，ΔΔCT=(CT目的基因-CT内参基因)病理组织-(CT目的基因-CT内参基因)正常组织。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组血清miRNA-200b的表达水平比较

各组提取总RNA 纯度均符合后续实验要求，且经溶解曲线发现为单一峰，跑胶验证为目的带。由图1可见，观察组患者miRNA-200b血清相对表达水平为(0.327±0.182)，明显高于对照组的(0.128 ±0.051)，差异有统计学意义(P<0.0001)。

图1 各组患者血清miRNA-200b的表达水平比较

2.2 miRNA-200b表达与临床病理特征的相关性

分析不同分期的NSCLC患者miRNA-200b的表达水平发现，血清miRNA-200b水平随着患者临床分期的升高而显著上升，其在Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期患者的表达水平分别为(0.213±0.132)、(0.277±0.101)和(0.359±0.178)(图2)。此外，NSCLC患者中肺鳞癌患者血清miRNA-200b表达水平为(0.427±0.242)，显著高于腺癌患者(0.199±0.103)(图3)。

图2 不同临床时期NSCLC患者miRNA-200b的表达水平比较

图3 不同类型NSCLC患者miRNA-200b的表达水平对比

2.3 观察组患者血清miRNA-200b表达水平诊断价值

通过线性回归分析发现，最佳cutoff值为0.276，其中敏感性46.7%，特异性93.3%，AUC值0.779(95%CI范围0.664～0.894；P<0.001)(图4)。

图4 NSCLC患者血清miRNA-200b水平作为诊断的ROC曲线图

3 讨论

许多研究表明，外周血miRNA在诊断不同人类疾病中可作为强有力的生物标志物。外周血中的miRNA主要由凋亡或坏死细胞释放，但也有细胞为和其他细胞之间相互作用而主动分泌的。因为外周血miRNA大多在外泌体和凋亡小体中，因此其能够保持高度的稳定[12-13]。近年来研究表明，正常肺组织恶化过程中有许多miRNA参与，其中部分表达升高与肺癌呈正相关性，特异性较高[14]。由于临床占位穿刺或者纤支镜活检组织均有创伤性，因而外周血等无创检测得到越来越多的应用，且对于早期预防、确诊等有重要的临床意义。

miRNA-200家族包括miR-200a、miRNA-200b、miRNA-200c、miRNA-141和miRNA-429共5个成员。已有的报道显示，miRNA-200家族在不同肿瘤中均有不同的表达，其中miRNA-200b在宫颈癌组织中高表达，而在胆囊癌等肿瘤中表达下调[15]。此外，前列腺癌和卵巢癌患者外周血中miRNA-200b较正常人水平明显升高[16]。从目前的研究结果来看，miRNA-200b与多个肿瘤发生密切相关，其可能在肿瘤的侵袭和转移过程中起着重要的作用。

本研究通过对NSCLC患者血清miRNA-200b水平进行检测，发现其与正常人相比显著升高。随后分析患者miRNA-200b与临床病理特征的相关性显示，随着临床分期从Ⅰ期到Ⅲ期增加，miRNA-200b水平明显升高，与NSCLC疾病发展呈正相关。同时，研究还发现NSCLC处于Ⅰ期时血清miRNA-200b的均值水平已高于对照组，表明其在NSCLC早期诊断具有一定的意义。此外，对于NSCLC不同肿瘤类型中的分析发现，肺鳞癌患者中血清miRNA-200b水平高于腺癌，显示出miRNA-200b对于NSCLC中肺鳞癌的诊断价值更高。最后，ROC分析发现，miRNA-200b的敏感性为46.7%，而特异性已超过90%，达到93.3%。敏感性较低可能考虑为miRNA-200b在血清中浓度较低导致的结果偏倚所致，因此还需要更多的临床标本和实验进一步证实。

总之，我们的研究发现NSCLC患者血清miRNA-200b水平显著升高，与临床分期的呈正相关，且与肺鳞癌相关性更高，表明其在NSCLC患者的疾病发展过程中起到重要的作用，可作为无创早期诊断NSCLC的指标之一。

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(编辑：甘 艳)

Expression of Serum miRNA-200b in Non-small Cell Lung Cancer and Its Clinical Significance

ZHULiqun,WANGChun,CHENJuxiang.People’sHospitalofLiyang,Liyang,213300

Objective To investigate the expression of serum miRNA-200b in non-small cell lung cancer(NSCLC) and its clinical significance.Methods A total of 45 NSCLC patients were selected as the observation group and 30 healthy humans without any cancer was the control group.The expression of serum miRNA-200b of the 2 groups were measured by qRT-PCR.Results The expression of serum miRNA-200b were significantly higher in the observation group (P<0.0001);Besides,serum miRNA-200b expression significantly increased with higher clinical staging(P<0.05);In addition,miRNA-200b was significantly correlated with patients with lung squamous cell carcinomas than lung adenocarcinomas (P<0.0001);Furthermore,the best cutoff value for serum miRNA-200b to diagnose NSCLC patients was 0.276 (sensitivity 46.7%,specificity 93.3%,and AUC 0.779).Conclusion NSCLC were associated with up-regulation of the expression of serum miRNA-200b and it has a critical role in NSCLC progression.miRNA-200b could be a novel serum miRNA biomarker for non-invasive early diagnosis of NSCLC.

miRNA-200b;Non-small cell lung cancer(NSCLC);Serum

213300 江苏省溧阳市人民医院

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.07.005

R734.2

A

1001-5930(2017)07-1059-03

2016-08-08

2017-03-09)