SIRT1基因的rs2273773和rs7895833突变与汉族人群冠状动脉疾病风险相关性分析

韩巧君，韩海荣，邹大进，连士杰，吴 惠，徐洪涛

·基因组学·

SIRT1基因的rs2273773和rs7895833突变与汉族人群冠状动脉疾病风险相关性分析

韩巧君，韩海荣，邹大进，连士杰，吴 惠，徐洪涛

目的 旨在调查汉族人群冠状动脉疾病患者SIRT1基因rs2273773和rs7895833的单核苷酸多态性。方法 共纳入77例冠状动脉疾病患者和80例对照者。所有冠状动脉疾病患者通过血管造影术确诊。通过巢式聚合酶链反应测定SIRT1基因rs2273773和rs7895833多态性的基因分型。结果 发现在中国汉族人群中，冠状动脉疾病患者和对照组SIRT1基因rs2273773和rs7895833的基因型频率差异无统计学意义(P＞0.05)。本研究人群具有相比于发表的荷兰人群rs7895833的显著不同的等位基因频率。结论 SIRT1基因遗传变异体rs2273773和rs7895833与中国汉族人群冠状动脉疾病无关。

冠状动脉疾病；巢式聚合酶链式反应；单核苷酸多态性；SIRT1基因

心脏病如冠状动脉疾病(coronary artery disease，CAD)的患病率随年龄增加而增加[1]。在老年动物的心肌中经常观察到凋亡和坏死的增加、肌细胞核的增殖、肌细胞体积的增加和结缔组织的积累[2]。Sir2蛋白近年来引起了很多关注，因为它在酿酒酵母中与热量限制下的寿命延长有关[3]。哺乳动物中，在Sir2蛋白家族中有7个成员，称为sirtuins(SIRT)。其中，SIRT1蛋白是酵母Sir2蛋白最接近的同源物[4]。SIRT1蛋白是一种能促进细胞调节的蛋白质脱乙酰酶。SIRT1蛋白具有许多生物学功能，包括转录调节、细胞分化抑制、细胞周期调节和抗细胞凋亡。SIRT1蛋白还具有保护心脏作用。Alcendor等[5]研究显示，SIRT1蛋白是无血清培养基培养心肌细胞中细胞存活的重要因子，抑制凋亡、减少氧化应激[6]。此外，Kao等[7]发现SIRT1蛋白表达在老化和动脉粥样硬化血管中减少，并且在内皮细胞中显著减少。用SIRT1基因的激活剂白藜芦醇可以有效地阻止H2O2处理过的人类脐静脉内皮细胞的衰老过程。白藜芦醇的抗氧化应激和抗衰老作用可以在H2O2处理过的人脐静脉内皮细胞中通过SIRT1基因抑制逆转。

鲜见关于SIRT1基因rs2273773和rs7895833多态性的分布或这些基因多态性与CAD发展风险的关联文献。因此，作者调查在中国汉族人群的冠状动脉疾病中这2种常见的SIRT1基因变异体。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2010年在第二军医大学长海医院住院的77例CAD患者为研究组，通过血管造影证实其中至少一个主要冠状动脉显示＞50%的狭窄。对照受试者包括145例常规体检人员，将具有心肌梗死和脑血管疾病史的受试者排除，通过结构式问卷和心电图排除亚临床CAD的可能性，最后选取80例作为对照组。所有受试者在纳入研究之前均知情同意。采用标准问卷从所有受试者收集关于种族、病史、有无糖尿病以及血脂异常和当前用药情况。所有研究对象都是中国汉族公民。

1.2 方法

1.2.1 实验室检查 通过标准实验室程序测量临床和生物化学指标。在不同时间间隔测量收缩压＞140 mmHg和(或)舒张压＞90 mmHg，目前服用抗高血压药物的受试者被认为有高血压。使用标准酶法测量总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇和三酰甘油水平。受试者中糖尿病定义为空腹血糖水平＞7 mmol/L，或者有使用抗糖尿病药物史的患者；如果总胆固醇浓度＞6.2 mmol/L和(或)其三酰甘油浓度＞2.3 mmol/L，则将定义为血脂异常。2组相关资料见表1。

表1 研究人群相关资料

1.2.2 遗传分析 使用DNA提取试剂盒[SK1261，(上海)Sangon公司]从外周血中提取基因组DNA。

通过使用正向引物(5′-TGTAGGTGTGTGTCGCA TCC-3′)和反向引物(5′-TAATGCTTTATCTCCACTTC TCG-3′)的巢式聚合酶链反应(nested polymerase chain reaction，nPCR)扩增含有主要单核苷酸多态性rs2273773的部分DNA序列(95℃5 min；然后95℃30 s、66℃30 s、72℃1 min，20个循环；再95℃30 s、58℃30 s、72℃1 min，20个循环；最后在72℃进行最终延伸步骤6 min；保持在4℃)。然后正向引物(5′-GCGGT CCCAAAAGGGTCAGTCCCAGGGTTCAACAAATCTATG-3′)和反向引物(5′-GCGGTCCCAAAAGGGTCAGTGC TTCCTAATCTCCATTACGTCGA-3′(95℃5 min；然后95℃25 s、66℃25 s、72℃40 s，20个循环；再95℃30 s、68℃1 min，20个循环；最后在72℃进行最终延伸步骤6 min；保持在4℃)。15 μL PCR混合物含有终浓度为50 pmol/μL的引物、25 mmol/L MgCl2、2.5 mmol/L的4种碱基脱氧核糖核苷三磷酸和5 U/ μL Taq聚合酶。将模板DNA(0.5 μL)引入外部反应混合物中。将0.1 μL外部PCR产物引入15 μL内部扩增混合物中。PCR产物在37℃下通过MboⅠ限制性内切核酸酶消化过夜，得到144 C等位基因的44、140 bp片段，以及144 T等位基因的非消化184 bp片段。通过在4%高分辨率琼脂糖凝胶上使用1×Tris-硼酸缓冲液在150 V电泳分离DNA片段。最后在每个基因型的2个样本中对基因型进行测序，以确认基因分型。

rs7895833使用初始扩增的正向引物(5′-TACC TCCCACTATACACACTCCA-3′)和反向引物(5′-TGA CTAGACAGGGCAGGATAAC-3′)、内部正向引物(5′-GCGGTCCCAAAAGGGTCAGTCCCAGGGTTCAACAAA TCTATG-3′)和反向引物5′-GCGGTCCCAAAAGGGT CAGTGCTTCCTAATCTCCATTACGTCGA-3′)，用于在63℃的退火温度下进行第2轮扩增。

1.3 统计学处理 应用SPSS 16.0软件，分类数据比较采用χ2检验，数值组间比较采用Student’s t检验，通过Hardy-Weinberg平衡测试基因型的分布，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 rs2273773和rs7895833多态性 研究组与对照组SIRT1基因的rs2273773和rs7895833多态性差异无统计学意义(P＞0.05，表2)，rs2273773和rs7895833多态性的分布和等位基因频率见表2。2组基因型的分布与Hardy-Weinberg平衡相一致(P＞0.05，表3)。

表2 2组rs2273773和rs7895833多态性

表3 2组等位基因和基因型频率平衡定律检验

2.2 rs2273773和rs7895833多态性样本电泳rs2273773和rs7895833多态性样本的琼脂糖凝胶电泳结果见图1。rs2273773多态性样本经nPCR扩增示TT、TC、CC基因型(图1A)。rs7895833多态性样本经nPCR扩增示AA、AG和GG基因型(图1B)。nPCR与测序数据一致。

图1 SIRT1基因rs2273773和rs7895833多态性样本琼脂糖凝胶电泳

3 讨论

尽管以前的研究证明，SIRT1蛋白在心脏和动脉粥样硬化血管中发挥作用[6-8]。本研究表明，SIRT1基因遗传变异(rs2273773和rs7895833)与汉族人群中的CAD不相关，但本组小样本量可能是一个原因，不能排除存在真正的关联。SIRT1蛋白属于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性组蛋白脱乙酰酶的SIRT蛋白家族。在低等生物体如酵母、苍蝇、蠕虫中，沉默信息调节剂Sir2蛋白与长寿相关[9-10]，在热量限制后延长寿命[11-13]。SIRT1蛋白位于细胞核和细胞质中[14]，与Sir2蛋白共享催化结构域[15]。研究表明，具有SIRT1的心脏特异性过表达转基因小鼠表现出延迟衰老和对抗心脏氧化应激的保护[6]。在具有SIRT1的心脏特异性过表达转基因小鼠中，SIRT1的低(2.5倍)至中度(7.5倍)过表达减少了年龄依赖性增长的心脏肥大、心肌细胞凋亡/纤维化[8]。在少量的人体研究中，单核细胞SIRT1蛋白表达在稳定的CAD和急性冠状动脉综合征患者中减少[16]。有研究观察到SIRT1基因的遗传变异与体重指数、肥胖风险、代谢反应、身体脂肪和血压有关[17-20]。rs7895833的次要等位基因与6 251例老年受试者的低体重指数相关[17]。对1 279例日本人的研究显示，携带rs7895833的A等位基因和rs2273773的T等位基因是男性肥胖的高危因素，而女性携带rs7895833的A等位基因、男性携带rs2273773的C等位基因是其高血压的高危因素，此外携带rs2273773的T等位基因是男性高血糖的高危因素[20]。另一104例研究中，SIRT1基因rs1467568和rs7895833在南非印第安人与早期发病的冠状动脉疾病相关[21]。

已知rs2273773(T/C，次要等位基因频率＝0.311，中国北京汉族人)及rs7895833(G/A，次要等位基因频率＝0.267，中国北京汉族人)(http:// www.hapmap.org)，rs2273773是同义单核苷酸多态性(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)。本研究显示与上述相似的次要等位基因频率结果。然而，荷兰人群中rs7895833的“主要”等位基因是中国汉族人群的“次要”等位基因；根据6 251例老年荷兰人群研究，rs7895833的G等位基因频率为0.20[17]。本研究中，rs7895833的G等位基因频率为0.71(表3)，与文献报道一致[20]。

目前不清楚SIRT1基因激活是否能作用于人体，由于潜在的多效性和组织依赖性生理功能，有人担心广义SIRT1基因活化也可能造成早衰或不利于健康。

总之，SIRT1基因遗传变异体rs2273773和rs7895833与中国汉族人群的CAD无关。rs7895833的次要等位基因频率不同于荷兰人群。本研究结论应该通过大样本重复研究来证实。

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The relationship between the rs2273773 and rs7895833 mutations of SIRT1 gene and the risk of coronary artery disease among Han Chinese

HAN Qiaojun1，HAN Hairong2，ZOU Dajin3，LIAN Shijie1，WU Hui1，XU Hongtao1
(1.Department of Cadre Health Care，Navy General Hospital，Beijing 100048，China；2.Department of Clinical Laboratory，Guanghua Chinese and Western Medicine Hospital，Shanghai 200052，China；3.Department of Endocrine，Changhai Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200433，China)

Objective To investigate the single-nucleotide polymorphisms rs2273773 and rs7895833 of SIRT1 gene in patients with coronary artery disease in the Han Chinese population. Methods Seventy-seven coronary artery disease patients and 80 controls were studied in the present study.All coronary artery disease patients were confirmed by angiography.The genotyping of polymorphisms rs2273773 and rs7895833 in SIRT1 gene was determined by nested polymerase chain reaction.Results However，there was no significant difference in genotype frequencies between coronary artery disease patients and controls in the Chinese Han population.In addition，our study cohort has considerably differing allele frequencies of rs7895833 compared to the Dutch population. Conclusion The rs2273773 and rs7895833 mutations of SIRT1 gene are not associated with the risk of coronary artery disease among Han Chinese.

Coronary artery disease(CAD)；Nested polymerase chain reaction(nPCR)；Single-nucleotide polymorphism(SNP)；SIRT1 gene

R543.3

B

2095-3097(2017)03-0147-04

10.3969/j.issn.2095-3097.2017.03.005

2017-02-25 本文编辑:徐海琴)

海军后勤部科研课题(CHJ12L024)

100048北京，海军总医院干部保健科(韩巧君，连士杰，吴 惠，徐洪涛)；200052上海，光华中西医结合医院(韩海荣)；200433上海，第二军医大学长海医院内分泌科(邹大进)

徐洪涛，E-mail:xuhongtao11＠tom.com

[注 明]韩巧君，韩海荣:并列第一作者