16S核糖体DNA Amplicon测序法分析2型糖尿病患者口腔微生物多样性

李宗泽，赵 泽，张文菲，陶 荣，孙雪飞，田 宇

16S核糖体DNA Amplicon测序法分析2型糖尿病患者口腔微生物多样性

李宗泽，赵 泽，张文菲，陶 荣，孙雪飞，田 宇

目的 探讨2型糖尿病患者口腔微生物多样性及结构的差异。方法 采集23例2型糖尿病患者与23名正常人的唾液与龈上菌斑样本，提取口腔菌群的总DNA，利用16S核糖体DNA(16S ribosome DNA，16SrDNA)Amplicon测序法进行测序，使用Pandaseq、Qiime等软件分析菌群多样性及结构。结果 2型糖尿病患者和正常人口腔菌群丰度及优势菌属差异无统计学意义(P＞0.05)。2型糖尿病患者样本中布雷德菌属、瘤胃菌科、幽门螺杆菌科丰度较高，正常人样本中韦荣菌科、Selenomonadales目、Negativicutes纲、月形单胞菌属、丁酸弧菌属、Anaeroglobus属、Candidatus-Saccharibacteria门、Saccharibacteria_genera_incertae_sedis属、诺卡菌科、气微菌属丰度较高，差异有统计学意义(P＜0.05)。结论 用16SrDNA Amplicon测序法分析2型糖尿病患者与正常人口腔菌群结构具有相似性，幽门螺杆菌与2型糖尿病之间的关系还有待于进一步的研究。

2型糖尿病；口腔菌群；16S核糖体DNA

2型糖尿病又称非胰岛素依赖型糖尿病，占糖尿病患者90%左右。近几十年来，在饮食结构上的变化及运动量的减少等多种因素影响下，2型糖尿病的发病率呈上升趋势，发病年龄呈年轻化趋势[1]。2型糖尿病作为与遗传因素和环境因素有关的一种影响全身多器官的慢性内分泌代谢疾病，常潜在发病，长期血糖升高，机体代谢紊乱，导致全身微循环障碍，使得包括口腔在内的全身器官发生并发症。而口腔作为人体的器官之一，在发生疾病时，会影响整个人体。口腔疾病与全身疾病两者相互影响，而口腔微生物的失调可诱发多种口腔疾病，且口腔微生物与全身健康关系密切[2]。

口腔微生物多样性研究，初期多采取人工培养的方法，但是许多口腔微生物不能采取原有的方法进行培养，能够培养的微生物种类可能不足一半[3]，致使对口腔中的微生物多样性认识不足。随着测序技术的快速发展，出现了16S核糖体DNA(16S ribosome DNA，16SrDNA)分析技术。测序技术是对口腔微生物群体进行高通量测序，分析序列的构成来确定特定环境中口腔微生物的构成情况、基因的组成以及功能。通过不同环境下口腔微生物的构成差异分析口腔微生物与环境因素或宿主之间的关系。

本研究采用Illumina测序平台对来自第四军医大学唐都医院内分泌科的2型糖尿病患者及其家属(与患者均为夫妻关系)口腔微生物样本进行多样性分析。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 研究对象 第四军医大学唐都医院内分泌科的2型糖尿病患者23例及其家属(与患者均为夫妻关系)23名，年龄30～65岁。23对受试者分为2组，2型糖尿病组与正常人组。2型糖尿病组唾液样本与龈上菌斑样本分别标注为A与a，正常人组唾液样本与龈上菌斑样本分别标注为B与b。

1.1.2 纳入标准

1.1.2.1 正常人 样本的选择需要满足:①近6个月未使用抗生素、可的松类激素、可刺激机体免疫系统的细胞因子、甲氨蝶呤等免疫抑制剂；②近6个月未大剂量使用益生菌(每日摄入量＞108 cfu)；③近7天内未使用局部抗生素(如漱口水)；④人类免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒阴性；⑤未在孕期及哺乳期的妇女；⑥无临床长期用药治疗的慢性病，如肺、心血管、胃肠道、肝脏和肾脏的慢性功能性疾病以及肿瘤等。

1.1.2.2 2型糖尿病患者 样本的选择需要满足:①近6个月未使用抗生素、可的松类激素、可刺激机体免疫系统的细胞因子、甲氨蝶呤等免疫抑制剂；②近6个月未大剂量使用益生菌(每日摄入量＞108 cfu)；③近7天内未使用局部抗生素(如漱口水)；④人类免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒阴性；⑤未在孕期及哺乳期的妇女；⑥无除2型糖尿病以外的需要长期用药治疗的其他慢性疾病。

1.2 方法

1.2.1 样本采集 对所有受试者进行全口检查。受试者采集样本前12 h应避免饮食、刷牙及使用牙线。临床样本采集方法:①唾液样本采集，本实验所采集的样本全部为非刺激性唾液。指导受试者让唾液自行流入50 mL离心管内，不能咳痰，采集量为10 mL。②龈上菌斑采集，使用灭菌刮匙刮取牙齿颊、舌侧龈上菌斑，置于1.5 mL的离心管内。所有样本均在冰浴下2 h内送至实验室，－80℃保存备用。1.2.2 DNA提取 样本4℃冰箱解冻，加入三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸缓冲液(pH 8.0)，震动5 min使样本充分混合于缓冲液内。使用快速纯化高品质DNA提取盒(QIAamp DNA Micro Kit，GER，德国Qiagen公司)提取细菌全基因组DNA。

1.2.3 引物设计并合成 16SrDNA扩增选择区域为V3～V4区，使用的通用引物为F341和R806。在通用引物的5′端加上适合测序的索引序列和接头序列，完成特异性引物的设计(图1)。

1.2.4 聚合酶链反应扩增、产物纯化及测序 以稀释后的基因组DNA为模板，使用预混热启动高保真酶试剂盒(KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCRkit，中国艾德科技公司)进行聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)，确保扩增的准确性和高效性。用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并用Axy-Prep DNA凝胶回收试剂盒(美国Axygen公司)切胶回收PCR产物。回收后，利用紫外微量分光光度计(Thermo NanoDrop 2000，美国赛默飞公司)和2%琼脂糖凝胶电泳进行质检。测序由上海锐翌生物科技有限公司Illumina平台来完成。通过16SrRNA Amplicon测序法进行双端(paired-end)测序。双端测序序列通过序列之间的重叠关系拼接成长序列，并对拼接后的序列进行质控，得到有效序列。对16SrDNA高变区序列进行测序，测序为V3～V4区；通过Pandaseq软件[4]利用重叠关系将双末端测序得到的成对序列拼接成一条序列，得到高变区的长序列。去除平均质量值低于20的序列；去除序列中含N碱基数超过3个的序列。

1.2.5 分析方法

1.2.5.1 可操作分类单元分析 将所有序列完全一样的有效序列根据其丰度大小进行排序，过滤掉其中的单独序列，在0.97相似度下进行聚类；对聚类后的序列进行嵌合体过滤，得到用于物种分类的可操作分类单元(operational taxonomic units，OTUs)；单个有效序列在OTUs序列上进行比对，将能比对上的序列提取出来，得到最终比对到的序列(mapped reads)[5-6]。根据比对到的序列绘制聚类Venn图，分析2型糖尿病患者与正常人口腔菌群的多样性。

1.2.5.2 物种丰度分析 根据物种注释结果，分别在门、属分类等级对各个样本作物种相应的柱状图，形成物种相对丰度柱状图，查看各样本在不同分类等级上相对丰度较高的物种和比例。

1.2.5.3 单个样本多样性分析 单个样本多样性是对样本内单个样本中物种多样性的分析，包括观察到的物种指数、丰度估计值指数、香农指数、辛普森多样性指数及系统发育多样性指数。利用Qiime软件[7-8]计算样本内单个样本物种多样性指数值，并作出相应的稀释曲线[9]。分别对单个样本多样性各个指数进行分析，2组样本比较使用R语言wilcox.test函数，筛选不同条件下差异有统计学意义的单个样本多样性分析指数。

1.2.5.4 样本间多样性分析 样本间多样性分析是用来比较一对样本在物种多样性方面存在的差异大小。

1.2.5.4.1 UniFrac热图分析 UniFrac是利用系统进化的信息来比较样本间的物种群落差异。其计算结果可以作为一种衡量样本间多样性的指数，它考虑了物种间的进化距离，该指数越大表示样本间的差异越大。本研究中UniFrac结果为加权UniFrac，加权UniFrac考虑了序列的丰度。UniFrac距离分布在热点图上，通过对UniFrac结果的聚类，具有相似的样本聚类在一起，反应样本间的相似性。根据各样本差异性的统计结果，对样本进行聚类分析并计算样本间距离，以判断各样本物种组成的相似性。

1.2.5.4.2 主坐标分析 为进一步展示样本间物种多样性差异，使用主坐标分析(principal coordinates analysis，PCoA)的方法展示各个样本间的差异大小[10-12]。横坐标表示第一主坐标，纵坐标表示第二主坐标，如果2个样本距离较近，则表示这2个样本的物种组成较相近。

1.2.5.4.3 多响应置换过程分析 多响应置换过程分析(multi-response permutation procedures，MRPP)是用于分析组间微生物群落结构差异的一种方法，统计量值大于0表明组间差异大于组内差异，观察值越小表明组内差异越小，预期值越小表明组间差异越小；P＜0.05为差异有统计学意义。

1.2.6 物种分析 在所有水平上通过R语言stats包kruskal.test函数找出2型糖尿病患者与正常人口腔唾液及龈上菌斑差异有统计学意义(P＜0.05)的物种。

2 结果

2.1 测序数据概况与OUTs聚类 23对样本16SrDNA高通量测序数据得到有效序列5 447 331条，平均长度419 bp，A、B、a、b样本对应的序列条数分别为1 372 856条、1 279 076条、1 361 548条、1 433 851条。A、B、a、b样本的测序深度为1.0，覆盖100%样本的微生物组。在97%相似性水平上进行聚类，共得到825个OTUs。A、B、a、b样本包含的OTUs数目分别为599、562、727、614个；其中，A、B样本共有的OTUs数目为519个，a、b样本共有的OTUs数目为557个，a样本特有的OTUs数目最多(170个)。见图2。

图2 OTUs Venn图分析

2.2 2型糖尿病患者与正常人之间口腔菌群结构

2.2.1 口腔菌群结构门水平 2型糖尿病患者与正常人的口腔唾液及龈上菌斑的菌群中，拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、梭杆菌门(Fusobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)为主要菌群，多达95%以上(图3)，2型糖尿病患者与正常人的口腔唾液与龈上菌斑菌群优势物种极其相似；唾液和龈上菌斑样本中优势物种所占比例不相同，唾液样本中优势菌群所占比例由大到小为拟杆菌门＞厚壁菌门＞变形菌门＞梭杆菌门＞放线菌门，龈上菌斑样本中优势菌群所占比例由大到小为梭杆菌门＞拟杆菌门＞厚壁菌门＞变形菌门＞放线菌门。

图3 2型糖尿病患者与正常人口腔菌群门水平柱状图

2.2.2 口腔菌群结构属水平 2型糖尿病患者与正常人的口腔菌群中唾液样本和龈上菌斑样本属水平均差异不大(图4)。

图4 2型糖尿病患者与正常人口腔菌群属水平柱状图

2型糖尿病患者与正常人的口腔菌群中唾液样本普氏菌属(Prevotella)、奈瑟菌属(Neisseria)、韦永球菌属(Veillonella)、链球菌属(Streptococcus)、卟啉菌属(Porphyromonas)、梭菌属(Fusobacterium)、拟普雷沃菌属(Alloprevotella)为优势菌属，多达80%以上，而龈上菌斑样本纤毛菌属(Leptortrichia)、普氏菌属(Prevotella)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、二氧化碳噬纤维菌属(Capnocytophaga)、月形单胞菌属(Selenomonas)、梭菌属(Fusobacterium)、韦永球菌属(Veillonella)、链球菌属(Streptococcus)为优势菌属。样本优势菌属中，唾液样本最多的菌属为普氏菌属(Prevotella)，龈上菌斑样本最多的菌属为纤毛菌属(Leptortrichia)。

2.2.3 单个样本多样性 单个样本多样性分析见图5。2型糖尿病患者与正常人口腔菌群各指数差异无统计学意义(P＞0.05，表1)。

2.2.4 样本间多样性分析

2.2.4.1 UniFrac热图 2型糖尿病患者与正常人口腔菌群的聚类分析见图6。

2.2.4.2 PCoA 2型糖尿病患者与正常人唾液样本、龈上样本PCoA见图7。

2.2.4.3 MRPP 2型糖尿病患者与正常人唾液样本及龈上样本菌斑组间MRPP差异无统计学意义(P＞0.05，表2)。

2.2.5 物种分析 2型糖尿病患者样本中布雷德菌属(Bulleidia)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、幽门螺杆菌科(Helicobacteraceae)丰度较高，正常人样本中韦荣菌科(Veillonellaceae)、Selenomonadales目、Negativicutes纲、月形单胞菌属(Selenomonas)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、Anaeroglobus属、Candidatus-Saccharibacteria门、Saccharibacteria_genera_incertae_ sedis属、诺卡菌科(Nocardioidaceae)、气微菌属(Aeromicrobium)丰度较高，2组物种差异有统计学意义(P＜0.05，表3。)

图5 样本物种丰度以及多样性指数稀释曲线图

表1 2型糖尿病患者与正常人唾液样本、龈上样本菌斑菌群单个样本多样性指数检验

图6 2型糖尿病患者与正常人唾液样本、龈上样本间多样性聚类分析UniFrac热图

图7 2型糖尿病患者与正常人唾液样本、龈上样本主坐标分析

表2 2型糖尿病患者与正常人唾液及龈上菌斑组间MRPP

表3 2型糖尿病患者与正常人口腔菌群所有水平上的主要物种

3 讨论

通过香农指数与辛普森多样性指数用来估算微生物群落的单个样本多样性，当指数曲线趋于平缓时表示此时的测序数据量比较合理，香农指数与辛普森指多样性指数值越大，多样性越高。本研究在对单个样本多样性各个指数分析表明，2型糖尿病患者与正常人无论是在唾液还是在龈上菌斑多样性差异均无统计学意义(P＞0.05，表1)。

在样本间多样性分析中，热图分析能够反应样本之间的相似性，蓝色越深表示物种的相似性越近，反之颜色越红表示物种的相似性越远。但本研究中，2型糖尿病患者的口腔菌群与正常人的口腔菌群混在其中，无法将聚类分开(图6)；组间MRPP从另外一个角度说明2型糖尿病患者的口腔菌群与正常人的口腔菌群组间差异无统计学意义(P＞0.05，表2)。

本研究结论可能导致的原因:①测序方法不同，不同的测序方法会导致获得信息的不同；②选择样本不同，口腔微生物是一个极其复杂的生态系统，不同个体之间的差异巨大；③在选取2型糖尿病患者的对照组时，特意选取的正常人与2型糖尿病患者为夫妻关系。做这样选择的目的就是为了观察共同的生活饮食习惯对口腔菌群变化是否存在影响。本研究显示夫妻间口腔菌群差异性较小，具有相似性。2型糖尿病患者与正常人的口腔菌群中，拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、梭杆菌门、放线菌门为主要菌群，高达95%以上。其中梭杆菌门是导致人类口腔疾病的重要菌门[13]；变形菌门被证实与口腔感染密切相关[14]；梭菌属易与螺旋体混合感染，会引起急性溃疡性龈炎、急性坏死性龈炎等，当牙周炎症加重时此菌数会大为增加、炎症减轻时数目又会减少，是牙周疾病治疗效果观察的指标之一；卟啉菌属是口腔菌属又一个与牙周病相关的菌属[15]，它可侵入牙龈成纤维细胞，并在相当浓度的抗生素作用下存活[16]。

本研究中，幽门螺杆菌在2型糖尿病患者中丰度较高，与正常人比较差异有统计学意义(P＜0.05，表3)。幽门螺杆菌是否与2型糖尿病存在相关性?目前，幽门螺杆菌感染与2型糖尿病之间的关系存在争议。Jeon等[16]对782例60岁以上既往无糖尿病史、且具有致病菌数据的萨克拉门托地区人群进行为期10年的回顾性研究发现，幽门螺杆菌感染与2型糖尿病之间存在显著关联。Chen和Blaser[17]分析了来自美国第3次(1988—1994年)和第4次(1999—2004年)全国健康与营养调查的数据，发现幽门螺杆菌与糖化血红蛋白水平呈正相关(P＜0.01)，但幽门螺杆菌感染与2型糖尿病之间无明显关联，提示幽门螺杆菌可能参与糖耐量受损的发生。需进一步研究口腔微生物的多样性与2型糖尿病之间的关系，深入研究口腔微生物的作用将有助于口腔疾病与系统性疾病的预防与治疗。

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Analysis of oral microbial diversity in patients with type 2 diabetes mellitus by 16S ribosome DNA Amplicon sequencing

LI Zongze，ZHAO Ze，ZHANG Wenfei，TAO Rong，SUN Xuefei，TIAN Yu
(Department of Endodontics，School of Stomatology，the Fourth Military Medical University，Xi’an Shaanxi 710032，China)

Objective To discuss the differences in microbial diversity and structure of oral type 2 diabetes mellitus.Methods The total DNA of saliva and gingival plaques were collected from 23 patients with type 2 diabetes mellitus and normal subjects.The total DNA of oral flora was extracted and sequenced by 16S ribosome DNA(16SrDNA)Amplicon sequencing.The diversity of flora was analyzed by Pandaseq and Qiime softuare.Results There was no significant difference in abundance and dominant bacteria between type 2 diabetes mellitus and normal population(P＞0.05).However，the prevalence of type 2 diabetes mellitus in the samples of Bulleidia，Ruminococcaceae，and Helicobacter pylori were rich and higher than normal(P＜0.05).While the genus Velvetiaceae，Selenomonadales，Negativicutes，Selenomonas，Butyrivibrio，Anaeroglobus，Candidatus-Saccharibacteria，Saccharibacteria_genera_incertae_sedis，Nocardioidaceae，and Aeromicrobium were rich in normal subjects(P＜0.05).Conclusion There was a significant difference in the structure of oral cavity flora between type 2 diabetes mellitus and normal people by 16SrDNA Amplicon sequencing，but the difference was not significant.The relationship between Helicobacter pylori and type 2 diabetes mellitus remains to be further studied in flora differences.

Type 2 diabetes mellitus；Oral flora；16S ribosome DNA(16SrDNA)

R781

B

2095-3097(2017)03-0151-06

10.3969/j.issn.2095-3097.2017.03.006

2017-02-23 本文编辑:徐海琴)

国家自然科学基金面上项目(81371140，81670974)；陕西省自然科学基础研究计划面上项目(2013JM4037)

710032陕西西安，第四军医大学口腔医院牙体牙髓病科(李宗泽，赵 泽，张文菲，陶 荣，孙雪飞，田 宇)

田 宇，E-mail:tianyu＠fmmu.edu.cn