人脐带间充质干细胞对实验性自身免疫性葡萄膜炎的治疗作用研究

秦力维，张宁坤，郭建巍，高 原，王桂琴，曹利群，田春雨，崔 蓓，王 静，陈 洁

人脐带间充质干细胞对实验性自身免疫性葡萄膜炎的治疗作用研究

秦力维，张宁坤，郭建巍，高 原，王桂琴，曹利群，田春雨，崔 蓓，王 静，陈 洁

目的 观察体外培养的人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUCMSCs)对实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis，EAU)的治疗作用。方法 组织块贴壁法培养HUCMSCs、流式细胞术鉴定。用视网膜光感受器间维生素A类结合蛋白(interphotoreceptor retinoid-binding protein，IRBP)诱导EAU模型。C57BL/6小鼠尾静脉注射HUCMSCs，每日用裂隙灯显微镜对小鼠眼前节的炎症情况进行观察。流式细胞术检测实验小鼠脾脏淋巴细胞CD11c、CD86表型。结果 建模后的C57BL/6小鼠于注射IRBP后7～9 d开始发病，12～14 d发病达高峰，16～20 d眼前节炎症自限性减轻，21 d后眼内炎症逐渐消退、自愈。HUCMSCs治疗后，建模小鼠EAU发病时间延长，炎症程度减轻，实验组与模型对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。建模后的小鼠脾脏CD11c＋CD86－细胞数量增加非常明显，经HUCMSCs治疗后第9天CD11c＋CD86－细胞数量接近治疗前水平。建模后小鼠脾脏中CD86＋CD11c＋/CD11c比值下降，经HUCMSCs治疗后有所回升，但在第15天时仍未恢复至正常水平。结论 HUCMSCs对IRBP诱导的小鼠EAU有治疗作用，HUCMSCs作用于树突状细胞等抗原呈递细胞，抑制了EAU的进展。

人脐带间充质干细胞；实验性自身免疫性葡萄膜炎；树突状细胞

葡萄膜炎是眼科常见的一种多因素影响的疾病，与感染、外伤、自身免疫、肿瘤等多种因素有关。其中，自身免疫性的内因性葡萄膜炎在临床上属于难治性葡萄膜炎，反复发病可造成视力明显下降甚至全盲。虽然激素、免疫抑制剂的使用，使葡萄膜炎的治疗有了飞跃性的进步，但不良反应的影响，限制了这类药物的长久、持续性以及在儿童、老人等特殊人群中的使用。探寻新的治疗方法一直是国内外眼科界同仁努力的方向。

本研究建立实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis，EAU)小鼠模型，制备人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUCMSCs)[1-2]悬液，对小鼠EAU治疗进行，观察及评价HUCMSCs在EAU治疗中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料 6～10周龄雌性健康C57BL/6野生型(wide type，WT)小鼠，海军总医院实验动物中心[SCXK(京)2011-0006]提供。光感受器间维生素A类结合蛋白(interphotoreceptor retinoidbinding protein，IRBP)多肽片段(第1169～1191氨基酸，PTARSVGAADGSSWEGVGVVPDV)由北京中科亚光生物科技有限公司合成。弗氏完全佐剂(美国Sigma公司)，百日咳毒素(美国Sigma公司)，所用流式抗体均购自美国Becton Dickinson公司。新生儿脐带取自海军总医院妇产科(37～40周胎龄剖宫产健康胎儿)。达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’s modification of Eagle’s medium，DMEM，美国Hyclone公司)，青霉素、链霉素(美国Hyclone公司)，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS，美国Gibco公司)。生物安全柜、CO2培养箱(美国Thermo公司)，倒置相差显微镜(日本Olympus公司)，普通离心机(杭州奥盛仪器有限公司)，恒温水浴箱(上海森信实验仪器有限公司)，一次性无菌培养瓶、离心管、移液管、过滤器(美国Gibco公司)。BD FACSCalibur流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)，功率15 W，激光光源采用氩离子气体激光器，波长488 nm，进行藻红蛋白(phycoerythrin，PE)、异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)、甲藻叶绿素蛋白等荧光素的检测；小功率半导体激光器，波长为635 nm，进行别藻蓝蛋白(allophycocyanin，APC)检测。YZ5G裂隙灯显微镜(上海精密仪器仪表有限公司)。

1.2 试剂配制 完全DMEM:90 mL DMEM＋20 mL特级FBS，100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素。

1.3 方法

1.3.1 HUCMSCs培养 无菌取剖宫产新鲜脐带，以平衡盐溶液洗去脐带残留血液，取血管之间血管与外膜之间的胶状物并剪切成小于1 mm×1 mm×1 mm小块，把组织块放置含15%FBS的DMEM，在37℃、5%CO2培养箱中培养。倒置显微镜下观察组织块，待组织块周围均有贴壁细胞出现时，移出组织块，当贴壁细胞扩增占80%～90%细胞瓶底面积时，用0.05%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸液消化后传代，用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)调整细胞为2×108/mL，0.01 mol/L PBS洗涤2次后，加入PBS 1 mL重悬细胞，取5× 106个细胞待用。本研究用第3代细胞进行实验。

1.3.2 HUCMSCs鉴定 取1×106个细胞，加100 μL的细胞表面染色缓冲液，根据抗体说明书加入相应体积的抗体(小鼠抗人PE、APC或FITC标志的单抗CD105、CD73、CD44、CD90、CD45)和人类白细胞抗原DR位点(human leukocyte antigen-DR，HLADR)，室温孵育30 min，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入500 μL PBS上机检测。

1.3.3 EAU模型的建立及HUCMSCs治疗EAU的临床评价 6～10周龄雌性健康C57BL/6 WT小鼠60只，随机数字法分为3组，其中模型对照组20只、共40只眼，HUCMSCs治疗组、空白对照组各20只、共80只眼。所有动物均足垫及颈部皮下注射500 μg的IRBP＋0.8 μg百日咳毒素＋等量的弗氏完全佐剂＋卡介苗0.4 μg共600 μL诱导EAU模型(双眼均造模)。造模的同时，模型对照组小鼠尾静脉注射生理盐水0.1 mL，HUCMSCs治疗组尾静脉注射HUCMSCs 0.1 mL(细胞5×106/mL)。随机选10只小鼠于造模前及造模治疗后每天用裂隙灯显微镜观察小鼠眼前节的眼部炎症情况，并进行半定量评分[1]。0分:无炎症反应；1分:虹膜充血和轻度的视网膜血管炎；2分:前房轻度纤维组织渗出；3分:前房明显渗出和轻度积脓；4分:前房重度积脓和出血。发现有角膜白斑、有晶状体混浊的不入组。眼前、后节检查均正常的入组。

1.3.4 脾细胞悬液制备 分别于造模后第9、15天处死各组小鼠，取脾脏，用0.01 mol/L pH 7.4 PBS洗涤2次，去除脂肪组织，研磨，用200目的尼龙网过滤制备脾细胞悬液，转移到10 mL离心管中，加PBS至10 mL，1 500 r/min离心5 min，洗涤2次，取1×106个细胞待用。

1.3.5 脾脏淋巴细胞表面蛋白标志 加100 μL的细胞表面染色缓冲液，根据抗体说明书加入相应体积的抗体，室温孵育30 min，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入500 μL PBS上机检测。分别在建模及治疗后的第9、15天用流式细胞术检测小鼠脾脏树突状细胞(dendritic cells，DCs)特异性标志CD11c和共刺激分子CD86表达及CD86＋CD11c＋/ CD11c比值变化情况。

1.4 统计学处理 应用SPSS 16.0软件，计数资料以百分比表示，各组间比较采用单因素方差分析，组内比较采用q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HUCMSCs的培养及生长情况 原代细胞培养24 h后，出现少量散在的单个贴壁细胞，形态呈纺锤形、纤维形，之后细胞逐渐增生，至第7、8天成为形态相对稳定的成纤维长梭形细胞，螺旋状或漩涡状排列生长(图1)。

图1 倒置差显微镜下的HUCMSCs(×400)

2.2 HUCMSCs免疫表型的鉴定 流式细胞术可见HUCMSCs符合髓系干细胞的特征。CD105/CD44和CD73/CD90高表达(图2)，CD34、CD45和HLADR基本不表达(图3)。

2.3 EAU模型临床表现 造模后第7～9天开始发病，可见虹膜血管扩张、充血，前房内有少量渗出。造模后14 d，病变达高峰，睑裂区大量白色黏稠分泌物，角膜轻度水肿，虹膜表面血管扩张、充血，前房纤维素样渗出增多，瞳孔区虹膜后粘连(图4A)；散瞳后观察前房混浊，有大量纤维素样渗出物覆盖于晶状体表面，前部玻璃体絮状混浊(图4B)。造模后16～20 d眼前节炎症减轻，21 d后眼内炎症逐渐消退、自愈。

图2 CD105/CD44和CD73/CD90分子表达

图3 CD34、CD45和HLA-DR荧光直方图

图4 EAU模型的裂隙灯观察

2.4 HUCMSCs对小鼠EAU的治疗 HUCNSCs治疗组与模型对照组相比，发病时间延长，炎症程度减轻。EAU临床评分见表1。

2.5 HUCMSCs治疗后脾脏淋巴细胞CD11c＋CD86－表达 建模后小鼠脾脏CD11c＋CD86－细胞数量增加，经HUCMSCs治疗后数量下降(图5)，治疗后第

9天CD11c＋CD86－细胞数量接近治疗前水平(图6)。EAU建模后小鼠脾脏CD86＋CD11c＋/CD11c比值下降即成熟DCs百分比下降，经HUCMSCs治疗后有所回升，但在第15天时仍未恢复至正常水平(图7)。

表1 小鼠EAU的临床评分(分)

图5 HUCMSCs治疗后小鼠脾脏CD11c＋CD86－细胞数量

图6 HUCMSCs治疗后第9天小鼠脾脏CD11c＋CD86－细胞数量

图7 HUCMSCs治疗后小鼠脾脏CD86＋CD11c＋/CD11c比值

3 讨论

葡萄膜炎主要是指发生在葡萄膜、视网膜、视网膜血管及玻璃体的一类炎症性疾病，反复发作可造成视力明显下降，严重时可导致失明，致盲率为2.8%～ 10.0%[3]。因病因复杂，目前对其确切的发病机制尚不完全清楚。EAU是研究人类葡萄膜炎理想的动物模型[4]，对揭示眼部炎症机制的研究起到非常重要的作用[5]。IRBP是视网膜表达的在EAU建模中应用最广泛的抗原，在体内具有免疫赦免的特性[6]。当某种条件下IRBP暴露，体内就会产生针对IRBP的免疫细胞，攻击视网膜的IRBP表达细胞，从而引发葡萄膜炎。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是来源于胚胎中胚层的一类成体干细胞，具有向多胚层细胞分化、向组织损伤部位定向迁移并促进损伤修复、免疫抑制、抗炎及神经营养等功能[7]。MSCs免疫原性极低，性能稳定，易于获得和扩增，同时允许同源和异源的移植[8]，已成功应用于自身免疫性疾病、移植物抗宿主病、神经损伤以及骨关节再生的治疗。由于MSCs不良反应少，可加强机体抗感染和神经营养作用，比传统的激素和免疫抑制剂有更多的优点，因此对难治性葡萄膜炎具有更大的潜在价值。

在前期的研究中，将体外培养的HUCMSCs注入小鼠体内，注入后观察到小鼠体内外周血细胞及免疫细胞的表型均没有明显的变化[2]，为后期进行异体干细胞的安全治疗提供了实践依据。

MSCs用于治疗视网膜疾病有2种移植方法，即静脉注射和局部注射。静脉注射的优势更为明显，它可以使MSCs通过血液循环到达整个视网膜，作用范围广，而且可重复注射[9-10]。本研究在建模的同时开始HUCMSCs干预治疗，采用尾静脉注射的方法，向小鼠体内注入HUCMSCs，观察HUCMSCs对EAU的治疗作用；通过对小鼠眼前节炎症的观察，发现小鼠EAU模型多在免疫后第7～9天开始发病，第12～14天达高峰，第16～20天病情缓解，21 d后炎症基本趋于消退。HUCMSCs治疗后小鼠EAU在发病时间、炎症程度上HUCMSCs治疗组与模型对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，具体表现为发病时间延长、炎症程度减轻。

DCs为体内功能最强的抗原呈递细胞。在EAU患者，研究发现DCs位于正常的脉络膜组织中，有一部分DCs在脉络膜视网膜的交界处，并与视网膜色素上皮接近，提示这些DCs与EAU肉芽肿的发生密切相关[11]；相当数量的DCs和单核巨噬细胞还渗入到脉络膜组织中。如何从DCs入手实现EAU的免疫治疗一直是关注和研究的热点[12-13]。本研究对治疗后小鼠脾脏DCs免疫表型进行分析，分别在建模后及治疗后的第9、15天用流式细胞术检测小鼠脾脏DCs特异性标志CD11c和其表面共刺激分子CD86表达情况，结果表明EAU发病后脾脏非成熟的DCs(CD11c＋CD86－)数量显著增加；经HUCMSCs治疗后脾脏非成熟DCs数量开始下降，到第15天时基本接近治疗前水平；同时，EAU建模后小鼠成熟DCs百分比下降，经HUCMSCs治疗后有所回升，但在第15天时仍未恢复至正常水平。

免疫学理论认为，未成熟DCs在摄取抗原后成为成熟DCs，成熟DCs可激活T细胞，并通过产生不同的细胞因子诱导初始辅助性T细胞(helper T cell，Th)向不同的Th亚群分化。EAU建模后脾脏中非成熟DCs数量增多，意味着EAU发病进程中，为了抑制自身免疫应答产生的免疫效应分子对机体的损伤，继续维持自身免疫系统的平衡，产生了大量未成熟DCs。未成熟DCs在摄取抗原前具有显著的免疫抑制功能，这些DCs表达低水平共刺激分子CD80和CD86，诱导T细胞耐受，避免免疫应答的持续进行。经HUCMSCs治疗后，非成熟DCs数量开始下降，治疗后第9天基本接近治疗前水平，维持了体内成熟DCs与非成熟DCs之间的平衡。

有学者将MSCs用于EAU的治疗，可抑制T细胞增殖、Th1和Th17细胞因子分泌，增强Th2细胞因子分泌，上调CD4＋CD25＋调节性T细胞，显著改善EAU临床症状，减轻其病理表现[14]。本研究结果提示，HUCMSCs对EAU治疗发挥作用的方式之一可能是作用于DCs等抗原呈递细胞，抑制了EAU的进展。能否在EAU发病初期就让HUCMSCs直接作用于DCs，通过调控免疫微环境而阻断DCs等抗原呈递细胞的功能[15-16]，发挥HUCMSCs在EAU治疗中的最大潜能将是下一步要做的工作。

[1]Gao LR，Zhang NK，Ding QA，et al.Common expression of stemness molecularmarkers and early cardiac transcription factorsin Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells [J].Cell Transplant，2013，22(10):1883-1900.

[2]秦力维，张宁坤，郭建巍，等.人脐带间充质干细胞的高效分离及对小鼠免疫功能的影响[J].转化医学杂志，2014，3(6):333-336.

[3]Read RW.Uveitis advances in understanding of pathogenesis and treatment[J].Curr Rheumatol Rep，2006，8(4): 260-266.

[4]Oh K，Kim YS，Lee DS.Maturation-resistant dendritic cells ameliorate experimental autoimmune uveoretinitis[J].Immune Netw，2011，11(6):399-405.

[5]Egwuagu CE，Sztein J，Chan CC，et al.Ectopic expression of gamma interferon in the eyes transgenic mice induces ocular pathology and MHC classⅡgene expression[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，1994，35(2):332-341.

[6]Caspi RR，Roberge FG，Chan CC，et al.A new model of autoimmune disease experimental autoimmune uveortinitis induced in mice with two different retinal antigens[J].J Immunol，1998，140(5):1490-1495.

[7]Salem HK，Thiemermann C.Mesenchymal stromal cells: current understanding and clinical status[J].Stem Cells，2010，28(3):585-596.

[8]Le Blanc K，Tammik L，Sundberg B，et al.Mesenchymal stem cells inhibit and stimulate mixed lymphocyte cultures and mitogenic responses indepently of the major histocompatibility complex[J].Scand J Immunol，2003，57(1):11-20.

[9]Wang S，Lu B，Giman S，et al.Non-invasive stem cell therapy in a rat model for retinal degeneration and vascular pathology [J].PLoS One，2010，5(2):e9200.

[10]Hou HY，Liang HI，Wang YS，et al.A therapeutic strategy for choroidal neovasculatization based on recruitment of mesenchymal stem cells to the sites of lesions[J].Mol Ther，2010，18(10):1837-1845.

[11]Forrester JV，McMenamin PG，Holthouse I，et al.Localization and characterization of major histocompatibility complex classⅡ-positive cells in the posterior segment of the eye:implications for induction of autoimmune uveoretinitis [J].Invest Ophthalmol Vis Sci，1994，35(1):64-77.

[12]郭建巍，秦力维，冯健男，等.基于RTB的新型免疫增强剂构建、表达及免疫效果评估[J].免疫学杂志，2013，29 (11):966-969.

[13]郭建巍，秦力维，冯健男，等.基于蓖麻毒素B链的新型黏膜免疫佐剂设计及靶向效果初步评价[J].中国免疫学杂志，2013，29(9):974-988.

[14]Zhang X，Ren X，Li G，et al.Mesenchymal stem cells ameliorate experimental autoimmune uveoretinitis by comprehensive modulation of systemic autoimmunity[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2011，52(6):3143-3152.

[15]Suzuki J，Yoshimura T，Simeonova M，et al.Aminoimidazole carboxamide ribonucleotide ameliorates experimental autoimmune uveitis[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2012，53(7):4158-4169.

[16]Treacy O，Ryan AE，Heinzl T，et al.Adenoviral transduction of mesenchymal stem cells:in vitro responses and in vivo immune responses after cell transplantation[J].PLoS One，2012，7(8):e42662.

Study of human umbilical cord mesenchymal stem cells for treatment of experimental autoimmune uveitis

QIN Liwei1，ZHANG Ningkun2，GUO Jianwei3，GAO Yuan1，WANG Guiqin1，CAO Liqun1，TIAN Chunyu1，CUI Bei1，WANG Jing1，CHEN Jie1
(1.Department of Ophthalmology，Navy General Hospital，Beijing 100048，China；2.Department of Cardiology，Navy General Hospital，Beijing 100048，China；3.Department of Clinical Laboratory，Navy General Hospital，Beijing 100048，China)

Objective To explore an effective treatment schedules of human umbilical cord mesenchymal stem cells(HUCMSCs)for experimental autoimmune uveitis(EAU)in C57BL/6 mice.Methods HUCMSCs were obtained by culturing cesarean section tissues from fetal umbilical cord in vitro by tissues adherent methods.HUCMSCs were identified by flow cytometry.EAU model of C57BL/6 mice were established by using interphotoreceptor retinoid-binding protein(IRBP). HUCMSCs were injected intravenous in C57BL/6 mice.Examine anterior asgment inflammation and hyphema by slit lamp microscope.The expression of CD11c and CD86 molecular of spleen lymphocytes were analyzed by flow cytometry.Results During the course of IRBP induced EAU in C57BL/ 6 mice，inflammatory reactions began at 7 to 9 days，peaked at 12 to 14 days and self relieved at 16 to 20 days.The intraocular inflammation disappeared entirely and spontaneous healed after 21 days. The onset time were prolonged and the inflammatory reaction were alleviated in IRBP induced EAU C57BL/6 mice，which had statistical significance(P＜0.05).The amounts of CD11c＋CD86－cells increased obviously in EAU mice and recovered at 9 days after administrated with HUCMSCs.The ratio of CD86＋CD11c＋/CD11c decreased in EAU mice and recovered gradually after administrated with HUCMSCs but still not to normal levels at 15 days.Conclusion The treatment method of HUCMSCswas effective for IRBP induced EAU in C57BL/6 mice.The data of CD11c＋CD86－cells from flow cytometry supported previous suggestions that HUCMSCs inhibit actions of dendritic cells substantially ameliorate the progression of EAU.

Human umbilical cord mesenchymal stem cells(HUCMSCs)；Experimental autoimmune uveitis(EAU)；Dendritic cells(DCs)

R773

A

2095-3097(2017)03-0142-05

10.3969/j.issn.2095-3097.2017.03.004

2016-12-06 本文编辑:张在文)

国家自然科学基金面上项目(30872394)；北京市自然科学基金资助项目(面上项目)(7162188)；海军总医院创新培育基金(CXPY201312)

100048北京，海军总医院眼科(秦力维，高 原，王桂琴，曹利群，田春雨，崔 蓓，王 静，陈 洁)，心血管内科(张宁坤)，检验科(郭建巍)

郭建巍，E-mail:jwkuo＠sina.com

[注 明]秦力维，张宁坤:并列第一作者