嗜热脂肪土芽孢杆菌普鲁兰酶基因的异源表达及重组酶性质

肖亚朋，沈微，李婷霖，陈献忠，樊游

1(江南大学，工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡，214122)2(江南大学，中国高校工业微生物资源数据平台，江苏 无锡，214122)

嗜热脂肪土芽孢杆菌普鲁兰酶基因的异源表达及重组酶性质

肖亚朋1，沈微2*，李婷霖1，陈献忠1，樊游2

1(江南大学，工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡，214122)2(江南大学，中国高校工业微生物资源数据平台，江苏 无锡，214122)

用PCR方法扩增得到嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)XQ3506的普鲁兰酶编码基因GsP，在大肠杆菌中进行异源表达。在没有外源信号肽的条件下，重组酶部分分泌到周质中，少量分泌到培养液中。重组酶表观分子量约为81 kDa，纯酶比活力为38.2 U/mg。重组酶最适温度为60 ℃，能短时耐受70 ℃高温；重组酶最适pH6.5，在pH5.5～7.5的范围内具有较好的稳定性；重组酶Km值为0.086 μmol/L，Vmax为0.083 μmol/min；K+和Mg2+对重组酶有激活作用，而Ca2+则有抑制作用。重组酶水解普鲁兰糖产物为单一麦芽三糖，对直链淀粉未发现降解作用，是一种I型普鲁兰酶。重组酶GsP在直链淀粉、抗性淀粉生产和粉丝酶法生产工艺中有一定的应用前景。

嗜热脂肪土芽孢杆菌；异源表达；I型普鲁兰酶；蛋白纯化；酶学性质

普鲁兰酶是一类淀粉脱支酶，目前工业化生产的普主要是针对淀粉制糖工业中的糖化工艺开发的耐酸性普鲁兰酶[1-3]。近年来，随着社会发展和产品的日益丰富，以普鲁兰酶为催化剂的新产品和新工艺不断被开发，例如以普鲁兰糖为原料的麦芽三糖制作工艺[4]，以淀粉为原料的直链淀粉、抗性淀粉[5-7]生产工艺，以及粉丝酶法生产工艺[8]等都需要用到普鲁兰酶。在这些产品的生产工艺中，反应条件不一定是酸性，但酶的热稳定性都对反应的顺利进行、防止杂菌污染以及酶的节约使用有所帮助。嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)具有较高耐热性，土芽孢杆菌属的模式株即属于该种。近年来，土芽孢杆菌属的Geobacillusthermoleovorans，以及该属的近缘种厌氧芽孢杆菌属的普鲁兰酶基因先后被克隆并报道了酶学性质[9-11]，而嗜热脂肪土芽孢杆菌的普鲁兰酶基因的表达与重组酶性质却未见报道。本研究将报道嗜热脂肪土芽孢杆菌 XQ3506普鲁兰酶基因在大肠杆中的高效表达以及重组酶的酶学性质。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株及质粒

出发菌株嗜热脂肪土芽孢杆菌和表达载体pLac03购自无锡先秦生物技术有限公司，产品编号分别为： XQ3506和XQ3619。G.stearothermophilusXQ3506的16S rDNA基因序列和pLac03全序列已登录美国国家生物技术信息中心(NCBI: www.ncbi.nlm.nih.gov)，登录号分别为：KX674365和KX674364。XQ3506的16S rDNA基因序列与嗜热脂肪土芽孢杆菌模式株IFO12550只有1个碱基差异。载体pLac03是一种以lac启动子控制外源基因表达的大肠杆菌表达载体。

1.1.2 工具酶和主要试剂

核酸内切酶EcoRI、HindIII，以及T4连接酶、ExtaqDNA聚合酶等均购自大连宝生物有限公司；胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、质粒提取试剂盒为康宁生命科学(吴江)有限公司产品；氨苄青霉素、IPTG 、SDS均购自上海生工生物工程技术服务有限公司；普鲁兰糖以及葡萄糖、麦芽糖等HPLC 检测标准品均购自Sigma公司；考马斯亮蓝G-250购自国药集团化学试剂有限公司；TB培养基购自北京吉美生物科技有限公司；其他试剂为国产分析纯试剂。

1.1.3 引物

在NCBI公布的嗜热脂肪土芽孢杆菌菌株22的基因组序列(登录号：NZ_JQCS01000088.1)中有一条推测为普鲁兰酶编码区的基因，据此设计扩增普鲁兰酶编码基因GsP的引物如下：

Pgst1: 5’-AATTACCGGAATTCTTATGCTTCAC￣A￣T￣C￣AGCCGAAC-3’

Pgst2: 5’-AATTACCGGGATCCTTATTTTCCGT￣T￣T￣T￣C￣CAC-3’

引物Pgst1与鲁兰酶基因编码区5’端一致，引物Pgst2与普鲁兰酶基因编码区3’端互补，引物5’-端各添加了EcoRI和BamHI识别位点。引物设计后由上海赛百盛基因技术有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 大肠杆菌重组表达载体的构建

提取嗜热脂肪土芽孢杆菌XQ3506的染色体DNA，以其为模板，用引物Pgst1和Pgst2进行PCR扩增，得到目标基因片段，用EcoR和BamHI酶切，电泳分离后回收目的片段，与经同样酶切的表达载体pLac03连接后转化大肠杆菌JM109 感受态细胞，在含氨苄青霉素的平板上挑取阳性转化子并提取质粒进行酶切验证和测序。

1.2.2 重组普鲁兰酶诱导表达及产物的SDS-PAGE分析

取重组菌单菌落接种含有氨苄青霉素的LB液体培养基，37 ℃，200 r/min振荡培养过夜。以1%的接种量转接至含有氨苄青霉素的50 mL TB液体培养基，37℃，200 r/min振荡培养。当菌体的OD600达到0.8时，加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/L继续振荡培养36 h，取适量菌液分别进行胞外、周质和胞质酶活检测。检测方法如下：12 000 r/min 离心1 min，收集上清液检测胞外酶活。菌体重悬于含有25%(w/v)蔗糖的高渗处理液中，冰浴4 h，离心去上清，菌体重悬于与发酵液等体积的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，离心，上清液为周质组分，沉淀部分超声波破碎获胞质组分。SDS-PAGE电泳分析重组酶在细胞周质及全细胞中的表达情况，使用Image Lab 4.0分析重组普鲁兰酶表观分子量。

1.2.3 重组普鲁兰酶的纯化与酶活测定

酶的纯化方法：取周质空间粗酶液2 mL，经0.22 μm滤膜过滤，pH 7.0，0.02 mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液平衡后上QFF 1 mL阴离子交换柱，用含1 mol/L NaCl的pH 7.0，0.02 mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液线形梯度洗脱，流速1 mL/min，自动部分收集器收集洗脱液，每管1 mL，逐管测定酶活力。然后SDS-PAGE 蛋白电泳验证纯化效果，考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，计算酶比活力，纯化倍数和回收率。酶活检测方法同文献[3]。

1.2.4 重组普鲁兰酶酶学性质研究

酶的最适温度测定：在45～70 ℃的范围内，间隔5 ℃测定不同温度对酶活性的影响，以最高酶活性为100%，计算各温度条件下酶的相对活性。最适pH测定：在pH4.5～8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，间隔0.5，测定酶活，以酶活最高者为100% ，计算相对酶活性。重组普鲁兰酶稳定性测定：将酶液分别在50、55、60、65、70 ℃金属浴中保温，间隔1.5、3、4.5、6、7.5、9 h分别取样测定酶活性，未经热处理的酶活性为100%，计算酶相对活性；金属离子对酶活影响的测定：以10 mmol/L浓度的金属离子盐溶液代替反应体系中的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，为避免金属离子与磷酸根反应，用去离子水替代缓冲液，用盐酸或NaOH调整至pH6.5，对照用水取代金属离子溶液，测定酶活力，对照为100%，计算酶相对活性。

1.2.5 重组普鲁兰酶动力学参数的测定

取8支1.5 mL离心管，依次加入浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 μmol/L 普鲁兰多糖溶液250 μL和最适pH缓冲液175 μL，预热5 min，再各加75 μL适当稀释的纯普鲁兰酶液(各管反应体系中的底物终浓度依次为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 μmol/L)，最适温度下反应5 min．空白管为对应的不同浓度的底物250 μL+缓冲液175 μL+蒸馏水75 μL，最适温度下进行反应。沸水浴终止反应后，DNS法测定还原糖量，计算不同底物浓度时的初速度(葡萄糖μmol/min)，用双倒数作图法求出酶的Km值和Vmax。

1.2.6 HPLC法分析重组普鲁兰酶水解普鲁兰多糖的产物

色谱条件：Waters XBridgeTMAmide液相色谱柱，流动相为乙腈-水(75∶25,V/V)，超声波脱气；柱温35 ℃；流速1.0 mL/min；进样量20 μL；检测器为HITACHI高效液相色谱仪示差折光检测器。采用外标法进行标定。

2 结果及分析

2.1 普鲁兰酶的异源表达与重组酶的纯化

以嗜热脂肪土芽孢杆菌 XQ3506基因组DNA为模板，用引物Pgst1、Pgst2进行PCR扩增，电泳显示扩增产物约2.2 kb，与预计的嗜热脂肪土芽孢杆菌普鲁兰酶基因编码区一致，该编码区片段命名为GsP。将上述PCR产物与质粒pLac03连接，获得重组质粒pLac03-GsP。任取4个重组质粒送上海生工生物技术服务有限公司测序。结果显示，4个质粒均为pLac03中插入GsP基因获得的重组质粒，4个质粒中插入的GsP基因序列完全一致。GsP基因全序列已登录美国国家生物技术信息中心(NCBI)，登录号为：KX674366。利用Blast软件将GsP与NCBI收集的全部核苷酸序列进行比对，结果显示其与Rozanov等提交的嗜热脂肪土芽孢杆菌22菌株的基因组序列(登录号：NZ_JQCS01000088.1)中一段标注为普鲁兰酶的序列相似性最高，两者有21个碱基差异，所编码的蛋白质只有4个氨基酸残基差异。与GsP同源性最高的有文献报道重组酶酶学性质的序列是AYADI等提交的来源于G.thermoleovorans的普鲁兰酶基因pulUS105[9]，两者编码区核苷酸序列相似性为79.9%，氨基酸序列相似性为82.5%。

将含重组质粒和空质粒的大肠杆菌 JM109/pLac03-GsP和JM109/pLac03按1.2.2的方法进行培养和诱导表达之后，分别对细胞不同组分进行酶活检测，结果显示，作为对照的大肠杆菌JM109/pLac03各组分中均检测不到普鲁兰酶酶活。大肠杆菌 JM109/pLac03-GsP周质空间和胞质内均检测到较高的酶活，折算到等体积发酵液，其酶活分别为16.8 U/mL和46.7 U/mL，胞外培养液酶活为2.3 U/mL。进一步对重组菌全细胞、周质空间组分进行SDS-PAGE 蛋白电泳检测，结果见图1。

M-蛋白marker; 1-JM109/pLac03-GsP周质组分; 2-JM109/pLac03-GsP周质组分纯化蛋白; 3-JM109/pLac03周质组分; 4-JM109/pLac03-GsP全细胞蛋白; 5-JM109/pLac03全细胞蛋白图1 重组普鲁兰酶SDS-PAGE电泳结果Fig.1 SDS-PAGE analysis of the recombinant pullulanase

由图1可知，JM109/pLac03-GsP的全细胞蛋白和周质空间蛋白在分子量80 kDa左右均有一明显的差异表达条带，同样条带在对照菌JM109/pLac03中均未出现。经软件Image Lab 4.0分析，重组蛋白相对分子质量约为81 kDa，与按照GsP基因序列推测的普鲁兰酶理论分子量81.3 kDa基本一致。上述研究结果显示，GsP基因的表达产物为普鲁兰酶。为便于叙述该重组酶命名为GsP。酶活检测和蛋白电泳检测结果显示，GsP蛋白有相当一部分可以分泌到周质空间及细胞外，而本研究所使用的表达载体pLac03并没有信号肽，用信号肽在线软件分析也未发现GsP蛋白中存在Sec途径或Tat途径信号肽。为了对GsP蛋白的分泌现象进行分析，将GsP蛋白氨基酸序列与NCBI网站收集的芽孢杆菌科来源的蛋白进行搜索比对，结果显示，在搜索结果中有文献报道具有分泌能力的蛋白中与GsP氨基酸序列最接近的是来源于枯草芽孢杆菌的AmyX蛋白，氨基酸序列同源性约50%。AmyX是通过Tat途径，即双精氨酸途径，以先折叠后分泌的方式分泌到细胞外，其N端有Tat途径信号肽，其中第5、6位两个相连的Arg是信号肽的核心区。GsP蛋白N端第6位仍然是Arg而第5位是Ser，这可能是信号肽分析软件无法发现其信号肽的原因。GsP蛋白第3位His是Arg6附近唯一带正电荷的氨基酸，这可能与其分泌功能有一定的关系。AYADI等研究pul US105的表达时发现在没有外源信号肽时其编码的普鲁兰酶不能分泌到周质或细胞外[9]，这可能与其培养菌体时使用LB培养基有关，本研究中也发现用LB培养基培养的重组菌表达的GsP蛋白几乎全部在细胞质中。GsP蛋白的分泌功能将在后续工作中进一步研究，此次主要研究GsP的应用性能。

由于周质空间杂蛋白较少，取周质空间粗酶液进行纯化。SDS-PAGE电泳结果(图1的第2泳道)显示，纯化产物显示为单一条带，检测结果显示GsP纯酶比活力为38.2 U/mg，纯化倍数为3.37倍，回收率为73.09%。

2.2 重组普鲁兰酶活性与温度和pH的关系

在pH 7.0条件下测定不同温度下的酶活力，温度-酶相对活性关系曲线见图2。由图2可见，GsP在55～60 ℃均有较高活性，60 ℃时活性略高，温度高于60 ℃酶活性迅速下降。

图2 温度对GsP酶活的影响Fig.2 Effects of temperature on the activity of GsP

在60 ℃条件下，分别测定不同pH值条件下的酶活，pH值-酶活相对活性曲线见图3。从图3可见GsP对pH变化很敏感，最适pH6.5，在pH6.0和pH7.0时，酶活只有最高酶活的70%左右。

图3 pH对GsP酶活的影响Fig.3 Effects of pH on the activity of GsP

2.3 重组普鲁兰酶的热稳定性

将酶液分别在50、55、60、65、70 ℃保温，间隔1.5 h分别取样测定酶活性。由图4可知，50 ℃和55 ℃保温9 h后，剩余酶活性仍有80%以上，60 ℃处理9 h，剩余酶活在70%以上，证明该普鲁兰酶具有较好的热稳定性。进一步检测显示，在60 ℃，GsP的酶活半衰期大约为20 h。GsP在65 ℃下失活较快，在保温1.5 h后酶活只剩40%左右，热处理9 h后，残存酶活不到15%。GsP能短时耐受70 ℃高温。

图4 GsP的热稳定性Fig.4 Thermal stability of GsP

2.4 不同金属离子对酶的催化活力的影响

几种常见金属离子对GsP酶活的影响如表1所示。K+和Mg2+能明显促进GsP活性；Zn2+、Ca2+对GsP活性有明显的抑制作用；Cu2+、Fe2+和Co2+三种重金属对酶活有强烈抑制作用。Ca2+和Mg2+对GsP活性的影响与其对PUL US105的作用有所不同，AYADI等发现，Ca2+对PUL US105酶活有促进作用而Mg2+则有轻微的抑制[9]。考虑到表1所采用的检测温度和金属离子浓度与文献有所不同，本研究进一步在金属离子浓度为5 mmol/L，温度为60 ℃和70℃条件下进行实验，结果依然显示Mg2+对酶活有明显促进作用而Ca2+有抑制作用。从上述实验结果看， PUL US105和GsP的稳定性可能都需要金属离子，Ca2+适合前者而Mg2+更适合后者。添加5 mmol/L Mg2+条件下，GsP在70 ℃下的酶活可以提高1倍以上。由于大部分淀粉的完全糊化温度在65～70 ℃左右，这一性质对GsP应用于直链淀粉及抗性淀粉的制备有重要意义。

表1 不同金属离子会对GsP催化活力的影响

2.5 重组普鲁兰酶的Km值和Vmax

在最适温度55℃和最适pH6.5的条件下，按1.2.4的方法检测GsP的动力学参数。计算不同底物浓度时的初速度(葡萄糖μmol/min)。利用Origin8.5做出重组普鲁兰酶催化普鲁兰多糖的V-[S]曲线图(图5)，并作出Linewaver-Burk双倒数曲线图(图6)。用双倒数作图法求出酶的Km值和Vmax。线性拟合得到的曲线方程为y=1.023x+11.9633，y代表反应初速度的倒数，x代表底物浓度的倒数。由此得重组酶的Vmax=0.083 μmol/min；Km=0.086 μmol/L。

图5 GsP催化普鲁兰多糖降解的V-[S]动力学曲线Fig.5 The V-[S]kinetic curve of the GsP catalyze pullulan degradation

图6 双倒数曲线图Fig.6 Linewaver-Burk double reciprocal curve

2.6 重组普鲁兰酶对普鲁兰糖的降解

取浓度为1%的普鲁兰糖溶液与过量普鲁兰酶反应，在普鲁兰糖完全降解后，降解产物进行HPLC检测，结果见图7。普鲁兰糖被降解后的产物中只有麦芽三糖。对标准样的检测显示，葡萄糖、麦芽糖在同样检测条件下的响应值大约是麦芽三糖的3倍，潘糖的响应值与麦芽三糖相当，由图7可见在上述3种糖相应的位置上均未见响应。由此可知GsP特异性水解普鲁兰多糖的α-1,6-糖苷键，不降解α-1,4糖苷键。进一步将GsP与0.2%的直链淀粉溶液混合后在55 ℃反应24 h，结果显示，淀粉液反应前后蓝值没有变化。可见GsP是一种专一性降解a-1,6糖苷键的I型普鲁兰酶。

图7 普鲁兰多糖降解后的产物分析Fig.7 Analysis of degradation products of pullulan

3 讨论

本研究以大肠杆菌为宿主，表达了嗜热脂肪土芽孢杆菌来源的普鲁兰酶基因GsP，表达产物GsP专一性降解普鲁兰糖中的a-1,6糖苷键，是一种I型普鲁兰酶，纯酶比活力为38.2 U/mg。GsP最适温度为60℃，最适pH为6.5，能短时耐受70 ℃高温，Mg2+能明显提高酶活性及热稳定性。有一些文献报道了来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermuphilus)的普鲁兰酶的性质，但大多与GsP有明显的差异。例如Kuriki在1988年先后报道了2种来源于B.stearothermophilus的DNA片段在枯草芽孢杆菌中表达的普鲁兰酶，其中来源于TRS40菌株的普鲁兰酶分子量62 kDa[12]，显然与GsP不是同一分子。另一种来源于TRS128菌株的普鲁兰酶分子量为83 kDa，与GsP比较接近，但两者酶学性质差异很大，例如5 mmol/mL的CoCl2可以明显促进前者酶活[13]，而同样条件却可以使GsP几乎完全失活。国内赵淑琴等报道了嗜热脂肪芽孢杆菌1.1923来源的普鲁兰酶的酶学性质[14-15]，与GsP相比前者具有较好的耐酸性，最适pH5.6，分子量55.6 kDa，从分子量判断两者不可能是同一种蛋白。产生上述差异的原因可能源于细菌分类标准的不同。土芽孢杆菌属主要来源于对嗜热脂肪芽孢杆菌的重新分类。B.stearothermuphilus建立于1920年，在其后近60年时间里是耐热性芽孢杆菌的唯一有效分类单位，这导致大量亲缘关系很远的耐热性细菌被归入其中[16]。以后分类学工作者对其进行了多次重新分类，建立了土芽孢杆菌(Geobacillus)、厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillus)等多个属，将原属于嗜热脂肪芽孢杆菌的细菌归入上述各个新建的属，并撤销了嗜热脂肪芽孢杆菌这一分类单位[16]。本试验对XQ3506菌株的鉴定主要是按照COORSVITS等在2012年建立的Geobacillus的新分类体系进行的，其中一个重要原则是种内16S rDNA基因序列相似性要高于99.3%[16]。其他研究者的菌株来源于不同历史阶段，其分类体系不可能完全一致，这可能是产生差异的原因，由于上述文献均未提供普鲁兰酶基因序列或菌株分类相关信息，其所用菌种在新分类体系中的地位难以确定。

经过多年的努力，国内外已有多种普鲁兰酶实现了工业化生产。表2是本课题组了解到的已经或基本实现工业化生产的几种普鲁兰酶的应用性能及其与GsP的比较。

表2所列5种普鲁兰酶均有较高的耐热性，Anoxybacillussp. LM18-11来源的普鲁兰酶的性质与GsP比较接近，均为中性普鲁兰酶，比较适合在直链淀粉、抗性淀粉生产及粉丝酶法制作工艺中应用，因为这些工艺都可以在中性条件下反应，特别是粉丝的酶法制作，必须在中性条件下进行反应。另外3种普鲁兰酶都是为淀粉制糖工艺开发的，因此都是酸性普鲁兰酶。

综上所述，本研究对嗜热脂肪土芽孢杆菌的普鲁兰酶基因进行了异源表达，重组酶为中性I型普鲁兰酶，具有较高的耐热性，能短时耐受淀粉糊化温度，在直链淀粉、抗性淀粉生产和粉丝的酶法制作工艺中有一定的应用前景。

表2 GsP与几种芽孢杆菌来源的耐热型普鲁兰酶的性能比较

注： “-”表示未检测。

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Heterologous expression of pullulanase gene fromGeobacillusstearothermophilusand characterization of the recombinant enzyme

XIAO Ya-peng1, SHEN Wei2*, LI Ting-lin1, CHEN Xian-zhong1, FAN You2

1(The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)2(Culture and Information Center of Industrial Microorganism of China Universities, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

GeneGsPencoding pullulanase was amplified from genome DNA ofGeobacillusstearothermophilusXQ3508 by PCR and heterologously expressed inEscherichiacoli. Despite absence of exogenous signal peptide, part of the recombinant enzyme was secreted to periplasm and culture medium. The apparent molecular weight of GsP was approximately 81.3 as measured by SDS-PAGE. Specific activity of the purified enzyme was 38.2 U/mg, and optimum pH and temperature of the recombinant enzyme were 6.5 and 60 °C, respectively. The enzyme could keep active within a short time at 70 °C. The maximal reaction velocity and Michael constant of the GsP was 0.083 μmol/min and 0.086 μmol/L, respectively. The enzyme activity of GsP could be increased by K+and Mg2+and partially inhibited by Ca2+. The GsP did not degrade amylose. High-performance liquid chromatography analysis showed that pullulan could be hydrolyzed by GsP and maltoriose was the single product. Thus, GsP belongs to type I pullulanase and it is thermostable. GsP can be applied in production of resistant starch and pure amylose.

Geobacillusstearothermophilus; heterologous expression; type I pullulanase; protein purification; enzyme property

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201705006

硕士研究生(沈微副教授为通讯作者,E-mail：13921108341@163.com)。

国家863高技术研究发展计划(2013AA102101-5)

2016-08-25，改回日期：2016-12-22