UPLC–MS／MS测定动物源食品中9种β-受体激动剂

倪炜华

(嘉兴市食品药品检验检测院，浙江嘉兴 314000)

UPLC–MS／MS测定动物源食品中9种β-受体激动剂

倪炜华

(嘉兴市食品药品检验检测院，浙江嘉兴 314000)

建立超高效液相色谱–串联质谱法检测动物源食品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林、氯丙那林、西马特罗、菲诺特罗、妥布特罗、喷布特罗等9种β-受体激动剂的方法。样品经β-葡萄糖醛苷酶酶解，用0.2 mol／L乙酸铵溶液(pH 5.2)提取，阳离子固相萃取柱净化，以乙腈–0.2%甲酸水溶液作为流动相进行洗脱，用Eclipse Plus C18(50 mm×2.1 mm，1.8 μm)色谱柱分离，采用多反应监测(MRM)模式进行定性和定量分析。9种β-受体激动剂的质量浓度在0.1～10.0 ng／mL范围内与定量离子丰度呈良好的线性关系，线性相关系数均大于0.999，检出限为0.1 µg／kg。平均回收率为85.0%～101.2%，测定结果的相对标准偏差为2.8%～9.5%(n=6)。该方法精密度好，灵敏度高，能简便、快速、准确地测定动物源食品中的9种β-受体激动剂。

超高效液相色谱–串联质谱法；动物源食品；β-受体激动剂

β-受体激动剂是一类化学合成的结构和功能类似于肾上腺素和去甲肾上腺素的苯乙醇胺类衍生物，用于治疗支气管哮喘、平滑肌痉挛等疾病［1］。β-受体激动剂在动物体内能促进脂肪分解，增强蛋白质的合成，提高酮体的瘦肉率。大剂量的使用β-受体激动容易造成其在动物体内残留蓄积，人类食用了有药物残留的动物源食品后会引发呼吸加剧、头痛、胸闷、心悸、心率加快、恶心和肌肉震颤等中毒症状，可诱发和加重心脑血管系统患者的病情，甚至导致其死亡。我国已经明确将这类药物列入饲养食品动物禁用药品目录。

目前国内外用于检测β-受体激动剂的方法主要有酶联免疫法［2］、高效液色谱法［3］、气相色谱–质谱法［4–7］、液相色谱串联四级杆质谱法［8–11］、液相色谱串联四级杆飞行时间质谱法［12，13］等。近两年的国家食品安全监督抽检和风险监测实施细则中，对动物源食品中β-受体激动剂的检测标准主要有GB／T 21313 《动物源性食品中β-受体激动剂残留检测方法 液相色谱–质谱／质谱法》、GB／T 22286 《动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定 液相色谱串联质谱法》、SN／T 1924 《进出口动物源食品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和特布他林残留量的测定 液相色谱–质谱／质谱法》，主要涉及的β-受体激动剂有克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林、氯丙那林、西马特罗、菲诺特罗、妥布特罗、喷布特罗等。笔者主要针对动物源食品中这9种β-受体激动剂，优化前处理方法，采用多反应监测(MRM)模式对其进行定性和定量分析。对上述标准进行一定的优化整合，提高工作效率，为国家食品安全监督抽检中对动物源食品中β-受体激动剂的检测提供有力的技术支持。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

液相色谱质谱联用仪：Agilent 1290 Infinity-6460型，配有电喷雾离子源，美国Agilent公司；

全自动固相萃取定量浓缩仪：Freestyle SPE GPC EVA型，上海磐合科学仪器股份有限公司；

电子天平：BS210S型，感量为0.1 mg，德国赛多利斯公司；

离心机：TCL–10B型，上海安亭科学仪器厂；

氮吹仪：N–EVAP型，美国Orgnomation 公司；

恒温水浴振荡器：SH–B型，上海精密仪器仪表有限公司；

克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林、氯丙那林：纯度分别为98.5%，97.0%，99.0%，98.5%，99.6%，德国Dr Ehrenstorfer 公司；

菲诺特罗溶液：100 mg/L，德国Dr Ehrenstorfer公司；

西马特罗、妥布特罗、喷布特罗：纯度分别为99.5%，99.8%，99.5%，德国Witega公司；

β-葡萄糖醛苷酶：不小于85 000 units／mL，美国Sigma-Aldrich公司；

甲醇、甲酸：HPLC级，德国Merck公司；

实验用水为超纯水；

盐酸、氨水：分析纯，上海化学试剂有限公司；

阳离子固相萃取柱：Waters oasis MCX3cc柱，60 mg／3 mL，美国Waters公司；

样品：市售。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

色谱柱：Eclipse Plus C18柱(50 mm×2.1 mm，1.8 μm，美国Agilent科技有限公司)；柱温：25℃；进样体积：5 µL；流动相：0.2%甲酸的水溶液–乙腈(体积比为70∶30)。

1.2.2 质谱条件

离子源：ESI+；干燥气温度：350℃；干燥气：氮气，流量为11 L／min；雾化气压力：345 kPa；毛细管电压：4 000 V；9种β-受体激动剂的多反应监测质谱条件见表1。

表1 多反应监测离子对及质谱条件

1.3 样品处理

1.3.1 提取

准确称取2 g匀质样品(准确到0.000 1 g)于离心管中，加入8 mL的0.2 mol／L乙酸铵溶液(pH 5.2)，再加入50 µLβ-葡萄糖醛苷酶，漩涡混合，于37℃水浴避光酶解过夜。次日于8 000 r／min下离心10 min，准确移取4 mL上清液于另一离心管中，用盐酸溶液(1+1)调节pH 2.5左右，漩涡震荡，于8 000 r／min下离心10 min。把上清液全部转移至净化瓶中，待净化。

1.3.2 净化浓缩

采用全自动固相萃取定量浓缩仪对提取液进行自动净化浓缩处理。MCX阳离子交换小柱依次用5 mL甲醇，5 mL水，5 mL 0.04 mol／L的盐酸溶液活化，活化完毕后，吸取全部提取液于MCX交换小柱中，流速控制在2～3滴／s，上样后依次用5 mL水、5 mL甲醇进行淋洗，然后用5 mL 5%的氨化甲醇进行洗脱，洗脱液全部收集在浓缩腔中，边洗脱变浓缩，至0.5 mL时，自动打开氮气开关，氮吹至干，准确吸取2.00 mL 0.2%甲酸水溶液至浓缩腔，振荡溶解，最后吸取1.5 mL溶液于收集盘上的进样瓶中，待测。

2 结果与讨论

2.1 净化条件的优化

采用全自动固相萃取定量浓缩仪对提取液进行自动净化浓缩处理，比较不同的固相萃取柱HLB、MCX对待测物的净化效果。结果表明，MCX柱子的保留能力及洗脱效果较好，适用于β-受体激动剂的净化。因为需要量把提取液pH调至2.5左右，所以在活化过程中以0.04 mol／L盐酸溶液进行活化。对5%氨化甲醇和5%氨化乙酸乙酯作为洗脱液的洗脱效果进行了比较，两者相差不大。5%氨化乙酸乙酯洗脱更干净一点，但由于氨水与乙酸乙酯互溶性差，不适用于批量自动化净化处理，所以选择5%氨化甲醇作为洗脱液。

2.2 提取条件的确定

由于β-受体激动剂苯环上的羟基是葡萄糖醛苷或硫酸酯的结合点位，这类化合物经过动物代谢后，多数转化为羟基结合葡萄糖醛苷或硫酸酯的代谢物。测定时需要将其解离转化为代谢前的化合物，本方法采用β-葡萄糖醛苷酶水解，水解后用盐酸调节提取液至pH 2.5左右，使其充分水解，同时保证β-受体激动剂的稳定性，从而提高回收率。

2.3 质谱条件

根据9种β-受体激动剂的结构特点，选择ESI+电离模式，生成较强的［M+H］+准分子离子，适于进行多级质谱研究。将1.0 mg／L的混合标准溶液以流动注射方式在正离子模式下进行母离子全扫描。在一级全扫描质谱中得到准分子离子［M+H］+，调节毛细管电压、离子源温度、碎裂电压等参数，使得［M+H］+峰的丰度最大；再对［M+H］+进行二级质谱分析，选择最佳子离子，同时优化碰撞电压，最后确定定量、定性离子对，结果见表1。9种β-受体激动剂的质谱多反应监测色谱图见图1～图9。

图1 菲诺特罗的MRM多反应监测色谱图

图2 莱克多巴胺的MRM多反应监测色谱图

图3 喷布特罗的MRM多反应监测色谱图

图4 克伦特罗的MRM多反应监测色谱图

图5 沙丁胺醇的MRM多反应监测色谱图

图6 妥布特罗的MRM多反应监测色谱图

图7 特布他林的MRM多反应监测色谱图

图8 氯丙那林的MRM多反应监测色谱图

图9 西马特罗的MRM多反应监测色谱图

2.4 线性回归方程、线性范围及检出限

配制克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林、氯丙那林、西马特罗、菲诺特罗、妥布特罗、喷布特罗9种β-受体激动剂质量浓度均为10.0 mg／L的混合标准溶液，分别稀释配成质量浓度为2，10，20，100，200 ng/mL的系列混合标准中间液，各加0.1 mL至空白样中，按实验方法处理，制得质量浓度分别为0.1，0.5，1.0，5.0，10.0 ng／mL的系列混合标准工作溶液，在1.2仪器工作条件下测定。以所得定量离子丰度对标准工作溶液的质量浓度进行回归分析，线性回归方程、线性相关系数见表2。按实验方法检测空白猪肉(2 g)中添加0.2 ngβ-受体激动剂的样品，9种β-受体激动剂的信噪比均大于3，因此把本方法的检出限定为0.1 µg／kg。我国目前检测β-受体激动剂的方法中检出限为0.1～0.5 µg／kg［14–15］，应用本实验方法可有效监控β-受体激动剂在动物养殖生产中的非法使用。

表2 线性回归方程及检出限

2.5 精密度与加标回收试验

以阴性猪肉样品为基体，添加克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林、氯丙那林、西马特罗、菲诺特罗、妥布特罗、喷布特罗9种β-受体激动剂的混合标准溶液，按实验方法测定，每个添加水平作6次平行测定，进行加标回收试验，结果见表3。由表3可知，动物源食品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林、氯丙那林、西马特罗、菲诺特罗、妥布特罗、喷布特罗9种β-受体激动剂的添加水平在0.2，1.0，5.0 µg／kg时，平均回收率为85.0%～101.2%，相对标准偏差为2.8%～9.5%(n=6)。本实验对该9种β-受体激动剂的回收率及精密度均符合药物残留分析的要求。

3 结语

建立了全自动固相萃取定量浓缩仪结合超高效液相色谱–质谱联用的方法检测动物源食品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林、氯丙那林、西马特罗、菲诺特罗、妥布特罗、喷布特罗9种β-受体激动剂的方法。该方法前处理步骤少，提取效率高，净化效果好，检出限低，精密度和准确度高，特别是过柱、浓缩以及最后的定量溶解转移至进样瓶全部由仪器完成。该方法能应对大批量的样品检测，满足近几年国家食品安全监督抽检和风险监测实施细则中对动物源食品中β-受体激动剂的检测要求。

表3 回收率及精密度试验结果(n=6)

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［15］GB／T 22286–2008 动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定 液相色谱串联质谱法［S］.

中国检验检测创新联盟成立

3月30日，以“支撑创新发展 服务美好生活”为主题的“2017广州国际检验检测论坛”在广州白云国际会议中心开幕。会上，中国检验检测创新联盟成立。

中国检验检测创新联盟在中国检验检疫学会的指导下，由中国境内部分知名检验检测机构共同发起成立中国检验检测创新联盟。目前首批联盟成员汇集了包括中国检测集团、必维国际检验集团、中汽认证中心、广州检验检测集团在内的64 家有影响力的检测认证机构和上市公司。发起机构既有国有事业单位和企业集团，也有外资企业和民营机构。

据联盟秘书处负责人刘展博士介绍，联盟成立后将做好五方面工作：

一、基于“互联网+检验检测”服务新模式，搭建“高效、可信、规范”的第三方检验检测网络服务平台，建立检验检测大数据研究应用中心。

二、制定联盟实验室开展网络化服务标准体系并审定认可联盟实验室，强化自律意识打造联盟品牌;建立联盟标准化服务机构，构建联盟标准化服务体系，拓展标准研发服务。

三、为联盟成员获取资质和政府采购服务提供技术支持;同时建立联盟实验室检测能力评价、质量监督体系及产品质量评价指数体系，协调监管部门认可联盟实验室资质和能力，采信联盟实验室检测结果。

四、发挥联盟纽带作用，以更好契合联盟成员需求为出发点，建立常态化合作机制，促进成员间的产业合作。通过形式多样的交流合作，推动成员间人员和项目交流、技术创新协同、市场开拓，全面提升联盟成员单位的整体能力。

五、积极落实国家《共同推动认证认可服务“一带一路”建设的愿景和行动》，引导联盟成员在“一带一路”框架下与沿线国家交流合作，共同开展国别制度研究、标准比对、能力验证等活动，以体制、技术、能力互信促进结果互认，扩大“中国检测”国际影响力，助推联盟成员服务“一带一路”建设。

据悉，中国检验检测创新联盟的成立以共建“一带一路”为契机，是多边合作共赢的重要举措。联盟将利用互联网思维搭建一条新的检验检测之路，争做创新服务的践行者、产品质量的守护者、品质生活的宣传者，为互联网+检验检测新业态发展、检验检测创新基础融合发展和质量强国建设发展贡献力量。 （中国分析计量网）

湖南：财政资金购置科研仪器要共享单台50万以上要查重评议

根据《国务院关于国家重大科研基础设施和大型科研仪器向社会开放的意见》(国发〔2014〕70号)、《关于贯彻落实创新驱动发展战略建设科技强省的实施意见》(湘发〔2016〕25号)、《湖南省促进重大科研基础设施和大型科研仪器向社会开放实施方案》(湘政办发〔2015〕68号)等文件。不久前，湖南省科学技术厅网站发布关于印发《湖南省科研基础设施和科研仪器向社会开放管理办法(试行)》的通知。

通知明确指出：全部或部分利用财政资金建设的科研基础设施和购置的科研仪器，除涉密外，均应对外开放共享;由社会资金建设的科研基础设施和购置的科研仪器鼓励向社会开放共享。

据悉，湖南省科技厅负责组织推动全省科研基础设施和科研仪器向社会开放共享工作，组织建设全省统一的科研设施和科研仪器开放共享服务平台(以下简称“共享平台”)，通过共享平台向社会定期发布全省科研基础设施和科研仪器开放共享目录，公布科研基础设施和科研仪器开放制度及实施情况。

此外，该通知还特别说明，湖南省科技厅、省财政厅还将对年度新立项科技计划项目拟以财政资金全额或部分出资新购单台套价值在50万元及以上的科研仪器开展查重评议。查重评议在省级科技计划项目批准立项之后、编制经费预算之前进行。对申请省级财政资金用于配套国家科技项目的，如该项目已通过国务院有关部门组织的评议，本省不再评议。

新购50万元及以上科研仪器评议申请书的内容主要包括：(一)科学研究和技术开发等科技创新活动需要新购科研仪器的必要性；(二)新购科研仪器功能指标的先进性、适用性，业务指标的合理性；(三)新购科研仪器的安装条件、技术队伍等配套支撑保障能力；(四)新购科研仪器的供货来源、采购方式、运行经费、预期效益等实施计划安排；(五)新购科研仪器的开放共享方案。 （仪器信息网）

Determination of Nineβ-agonists in Animal Food by UPLC–MS／MS

Ni Weihua
(Jiaxing Institute for Food and Drug Control， Jiaxing 314000, China)

A method was established for the determination of nineβ-agonists(clenbuterol，ractopamine，salbutamol，terbutaline，clorprenaline，cimaterol，fenoterol，tulobuterol，penbutolol) in animal food by UPLC–MS／MS. The samples were enzyme hydrolyzed byβ-Glucuronidase sulfatase，extracted with 0.2 mol／L ammonium acetate solution (pH 5.2)，and cleaned up on a SPE cartridge，separated on a C18column(50 mm×2.1 mm×1.8 μm) by using elution with acetonitrile and water(containing 0.2% formic acid) as mobile phase. Qualitative and quantitative analysis were carried out in multiple reaction monitoring (MRM) model. The mass concentration of nineβ-agonists showed good linearity in the range of 0.1–10.0 ng／mL with quantitative ion abundance，the detection limit of nineβ-agonists was 0.1 μg／kg. The average recoveries were 85.0%–101.2%，the relative standard deviations ranged from 2.8% to 9.5%(n=6). The method is simple and rapid with good precision and accuracy，it is suitable for the determination of nineβ-agonists in animal food.

UPLC–MS／MS; animal food;β-agonist

O657.7

A

1008–6145(2017)03–0067–05

联系人：倪炜华；E-mail: niweihua2001@163.com

2017–03–07

10.3969／j.issn.1008–6145.2017.03.016