LC–IT–TOF MS法分析湖南黑茶中水溶性成分＊

颜鸿飞，王美玲，邹灿，陈练，吕小园，戴洁芸

(湖南出入境检验检疫局，国家食品安全检测重点实验室，长沙 410004)

LC–IT–TOF MS法分析湖南黑茶中水溶性成分＊

颜鸿飞，王美玲，邹灿，陈练，吕小园，戴洁芸

(湖南出入境检验检疫局，国家食品安全检测重点实验室，长沙 410004)

建立了湖南黑茶中水溶性成分的液相色谱–离子阱串联飞行时间质谱(LC–IT–TOF MS)快速分离和确证方法。实验用90℃热水恒温提取湖南黑茶样品中水溶性成分，采用液相色谱–离子阱串联飞行时间质谱仪对其中的水溶性提取物进行分离测定。利用准确质量数匹配和自建质谱数据库检索，结合保留时间、多级质谱、特征碎片离子等信息，对湖南黑茶中的43种水溶性化合物的进行了初步确证。该法可得到黑茶独特滋味品质的特征成分，为湖南黑茶品质评价和质量控制提供了一种新的技术手段。

液相色谱–离子阱串联飞行时间质谱；湖南黑茶；水溶性成分

以安化黑茶为代表的湖南黑茶不仅获得了非物质文化遗产的殊荣，还被评为国家地理标志产品，成为国内外茶叶市场新贵，深受广大消费者青睐［1］。茶叶含有丰富的化学成分如儿茶素、咖啡碱、黄酮类、酚酸、茶皂素、糖、有机酸、氨基酸和芳香物质等代谢产物，是构成其风味特征的物质基础。茶叶种植的产地、气候、环境等因素的不同，造成它们的化学成分的种类及含量差异。通过鉴定和分析茶叶中特定化学成分来对茶叶品质、产地溯源和生产工艺等进行科学评价，已经成为茶叶成分代谢组学研究的热点。当前茶叶中水溶性成分研究主要采用比色法［2］、高效液相色谱法(HPLC)［3–4］、高效毛细管电泳色谱法(HPCE)［5］、薄层色谱法(TLC)［6］和液相色谱–质谱法［7–8］，其中液相色谱–质谱联用技术逐渐成为茶叶水溶性成分研究的重要技术手段。但大部分液相色谱–质谱方法采用低分辨的离子阱或四级杆质谱，存在着化学结构信息缺失或不全的可能性，成分结构解析的准确性有待提高。由于茶叶样品基质复杂，许多化学成分结构和性质相似，需要用定性能力更强的高分辨率质谱或串联质谱来对茶叶组分进行精准分析。离子阱串联飞行时间质谱(IT–TOF MS)兼具离子阱和高分辨飞行时间质谱的快速检测能力，可同时提供母离子精确质量数及多级碎片离子信息，在化合物快速鉴定中得到越来越广泛的应用［9–18］。笔者采用LC–IT–TOF MS对湖南黑茶中水溶性成分进行分离和正、负离子模式同时扫描测定，利用准确质量数匹配和自建质谱数据库检索，结合保留时间、多级质谱和特征碎片离子等信息对其中的43种水溶性化合物进行鉴定分析，获得了湖南黑茶滋味品质的特征成分，对湖南黑茶的质量控制、品质评价、真伪鉴别和保健功能开发均有重要意义。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱／离子阱–飞行时间／串联质谱仪：日本岛津公司；

超声波清洗器：B8510E型，美国Branson公司；

高速离心机：1–15P型，德国Sigma公司；

研磨仪：GRINDOMIX GM200型，德国Retsch公司；

样品：湖南黑茶，市售；

乙腈：色谱纯，德国Merck公司；

实验用水为超纯水；

没食子酸、没食子儿茶素、可可碱、茶碱、表没食子酸儿茶素、儿茶素、咖啡因、表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素、没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、儿茶素没食子酸酯标准品：纯度不小于98%，美国Sigma公司；

绿原酸、咖啡酸、茶黄素、杨梅素、榭皮素、山奈酚标准品：纯度均不小于98%，日本和光纯药工业株式会社。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 液相色谱条件

色谱柱：Phenomenex C18柱(150 mm×4.6 mm，

3.5 μm，美国菲罗门公司)；流量：0.3 mL／min；进样体积：10 μL；柱温：40℃；检测波长：254 nm；流动相：A为乙腈，B为0.1%乙酸水溶液，梯度洗脱条件见表1。

表1 梯度淋洗程序

1.2.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源(ESI)，正负离子同时扫描；扫描范围：m／z100～1 000；加热模块温度：200℃；CDL温度：200℃；雾化气流量：1.5 L／min；干燥气流量：10 L／min；离子源电压：正离子模式为4.5 kV，负离子模式为–3.5 kV；检测器电压：1.7 kV；质量数校准方法：自动调谐优化电压，外标法校准质量数；分子式预测软件为Shimadzu Formula Predictor。

1.3 数据处理

利用Profiling Solution软件对所有样品数据进行处理。保留时间范围：1～20 min；质量范围：m／z100～1 000；质量允许偏差：5 mDa；强度阈值：50 000；保留时间允许误差：0.5 min；数据处理结果进行峰值获取，并列出每个峰的m／z值、保留时间和信号强度，以提取离子峰的m／z值和信号强度值来创建峰列表。

化合物的定性分析方法：①用Met ID solution软件，通过分析质谱找出化合物的分子离子峰，将待鉴定色谱峰的精确分子量及分子式在自建的数据库中搜索精确分子质量数、同位素比相匹配的化合物，进行快速筛查，并根据多级质谱碎片离子进行确证；②查阅相关文献，筛选出可能的化合物；③对于文献中未报道的未知化合物，根据获得的准确质量数信息预测其分子式，并在化合物信息查询网址中搜索分子式，同时根据多级质谱及碎片离子的裂解规律进行确证鉴别。

1.4 实验步骤

取有代表性的茶叶样品500 g，经粉碎机粉碎，过0.83 mm(20目)筛，混匀，均分成两份作为试样，分装入洁净的容器内，密封并标记，常温下保存。在制样和储存过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。

称取1.0 g上述茶试样(精确到0.01 g)置于50 mL具塞聚四氟乙烯离心试管中，加入90℃热水25 mL，并在90℃恒温水浴中浸泡提取20 min，期间每隔10 min振摇1次。提取后，冷却至室温，定容至50 mL，取上层清液1 mL，以10 000 r／min离心10 min，过0.22 μm滤膜，作为试样液供LC–IT–TOF MS测定［20］。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化

实验考察了常见的几种流动相：水–甲醇、水–乙腈，5 mmol/L乙酸胺–乙腈、0.1%乙酸–甲醇和0.1%乙酸–乙腈等体系对分离效果、色谱峰形及质谱响应强度的影响。实验发现采用水–乙腈、水–甲醇和5 mmol/L乙酸胺–乙腈作流动相，有部分色谱峰拖尾现象较严重，分离效果欠佳。往流动相中添加适量乙酸(0.1%)后，色谱峰型有所改善，基线更平稳，分离效果得到明显改善。但随着乙酸浓度的增大，质谱响应强度反而有所下降，可能是黑茶中含有较多的酚羟化合物，酸度太强则抑制了某些化合物的离子化。在相同流速和梯度下，0.1%乙酸–乙腈较0.1%乙酸–甲醇的分离效果和质谱响应信号更好。所以，选择0.1%乙酸–乙腈为流动相。

2.2 质谱条件优化

黑茶中水溶物成分十分复杂，含有大量的有机酸、寡糖、酚酸、氨基酸、黄酮和糖苷等成分。大部分化合物在正负离子模式下均能电离，但负离子模式响应大于正离子模式，只有小部分化合物如咖啡因、可可碱、茶碱等生物碱类化合物只在正离子模式下有响应。为充分利用离子阱串联飞行时间质谱的快速正负极转换功能，对样品进行正、负离子模式应同时扫描，实现一次进样可同时获得分析成分的正负离子质谱数据，为化合物鉴别增加了新的参考信息。此方法节省了分析时间，提高了定性分析的速度和可靠性。此外，对质谱的离子源温度、干燥气流和检测器电压进行优化，能够使大部分目标化合物有良好的信号响应，检测灵敏度和质谱采集质量得到进一步提高，使得定性鉴别的结果更加可靠。

2.3 湖南黑茶水溶性成分分析

在1.2仪器条件下，对湖南黑茶样品溶液进行分析，图1为样品溶液的LC–IT–TOF MS全扫描总离子流图。由图1可知，一些化合物在正负离子模式下均有响应，负离子模式下出现的峰多于正离子模式下出现的峰。所得的高分辨质谱数据，可通过Met ID solution定性分析软件中特征提取技术将样品中大于一定丰度的化合物提取出来，在自建的数据库中搜索精确分子质量数匹配的化合物，进行快速筛查，并根据多级质谱碎片离子进行确证。代表性物质的质谱图和二级质谱图见图2、图3。

图1 湖南黑茶样品正负离子模式下的全扫描总离子流图

图2 槲皮素的一级质谱图(a)及其二级质谱图(b)(ESI–)

图3 表儿茶素的一级质谱图(a)及其二级质谱图(b)(ESI–)

表2为湖南安化黑茶样品中各峰的测定数据和鉴定结果，可以看出，黑茶中水溶性化合物主要有糖类、有机酸类、酚酸类、氨基酸类、黄酮及黄酮苷类和多酚类，这些物质都是形成黑茶茶汤特殊风味的重要物质。实验中还发现其它未知峰成分需在以后的研究中采用所对应的标准品或者利用其它技术进一步确证。

3 结语

建立了湖南黑茶中水溶性成分的LC–IT–TOF MS非靶标分析方法，利用离子阱–飞行时间串联

质谱快速正负极转换检测能力，对主要成分的精确分子质量数、多级质谱碎片离子等信息进行有效分析和鉴别。通过该方法初步确证了43个水溶性化学成分，其它未知成分需在以后的研究中采用所对应的标准品或者利用其它确证技术进一步确证。结果表明，湖南黑茶中水溶性化合物主要有糖类、有机酸类、酚酸类、氨基酸类、黄酮及黄酮苷类和多酚类等，这些物质构成了湖南黑茶茶汤独特风味。

表2 湖南黑茶样品中化合物的保留时间及质谱特征

［1］孟涛，邹勋.安化黑茶产业现状与发展策略［J］.茶叶通讯，2011，38(1): 17–20.

［2］周国兰，喻云春，胡华健，等.茶花与茶叶常规生化成分分析研究［J］.茶叶，2009，35(2): 85–86.

［3］康海宁，陈波，韩超，等. HPLC 法测定茶叶水提取液中五种儿茶素和咖啡碱及其用于茶叶分类的研究［J］.分析测试学报，2007，26(2): 211–215.

［4］白秀芝，王美玲，颜鸿飞，等.高效液相色谱指纹图谱和随机森林应用于湖南安化黑茶水溶性成分的研究［J］.分析测试学报，2014，23(11): 1 268–1 273.

［5］夏文娟，张丽霞，王日为.毛细管电泳法同时分析茶黄素类和儿茶素类化合物［J］.色谱，2006，24(6): 592–596.

［6］王丽丽，王坤波，黄建安，等.茶叶中儿茶素薄层色谱分离所用展开剂的优化［J］.湖南农业大学学报：自然科学版，2012，38(1): 102–105.

［7］梁华正，陈焕文.表面解吸常压化学电离质谱法快速测定茶叶化学指纹图谱［J］.应用化学，2008，25(5): 519–523.

［8］卢嘉丽，王冬梅，苗爱清，等.白叶单枞和黄观音茶树芽叶中茶多酚的HPLC–DAD／MS／MS分析［J］.中国药学杂志，2007，42(l9): 1 456–1 458.

［9］王美玲，颜鸿飞，傅善良，等.高效液相色谱–离子阱飞行时间质谱对保健食品中激素类成分的快速筛查和确证［J］.色谱，2012，30(10): 980–985.

［10］张帆，颜鸿飞，戴洁云，等.食品多组分添加剂及非法添加物的HPLC–HRMS广谱筛查［J］.食品与机械，2016，32(8): 42–48.

［11］夏云，陈黎，王静蓉，等.超高效液相色谱–飞行时间质谱联用分析柏芩清火颗粒中的化学成分［J］.中南药学，2011，9(3): 166–169.

［12］张磊，曾仲大，叶国柱，等.基于气相色谱–质谱联用与液相色谱–质谱联用的非靶向代谢组学用于3类茶叶中化学成分分析［J］.色谱，2014，32(8): 804–816.

［13］Zhao Y，Chen P，Lin L，et al. Tentative identification quantitation，and principal component analysis of green pu-erh，green，and white teas using UPLC／DAD／MS［J］. Food Chemistry，2011，126(3): 1 269–1 277.

［14］Del Rio D，Stewart A J，Mullen W，et al. HPLC–MS analysis of phenolic compounds and purine alkaloids in green and black tea ［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004，52(10): 2 807–2 815.

［15］Junfeng Tan，Weidong Dai，Meiling Lu，et al. Study of the dynamic changes in the non-volatile chemical constituents of black tea during fermentation processing by a non-targeted metabolomics approach［J］. Food Research International，2016，79(1): 106–113.

［16］Qi Lianwen，Li Ping，Ren Meiting et al. Application of highperformance liquid chromatography electrospray ionization time-of flight mass spectrometry for analysis and quality control of Radix Astragali and its preparations ［J］. Journal of Chromatography A，2009，1 216(11): 2 087–2 097.

［17］董静，王弘，万乐人，等.高效液相色谱／电喷雾–离子阱–飞行时间质谱分析鉴定中药虎杖中的主要化学成分［J］. 色谱，2009，27(4): 425–430.

［18］芮雯，冯毅凡，刘守钾，等.毛茛黄酮类成分的UPLC HILIC／Q–TOF–MS分析［J］. 亚太传统医药，2011，7(8): 18–21.

农业部重点实验室主任、科学观测实验站站长名单公布

2016年末，农业部曾公布“十三五”农业部重点实验室及科学观测实验站建设名单。《通知》中指出，“十三五”期间将形成由42个综合性重点实验室、297个专业性(区域性)重点实验室和269个科学观测实验站组成的37个学科群农业部重点实验室体系。随着实验室建设工作的落地开展，农业部不久前也批准了重点实验室主任、学术委员会主任和农业科学观测实验站站长人选。其中，批准林敏等专家担任农业部重点实验室主任，批准赵国屏等专家担任农业部重点实验室的学术委员会主任，批准李锡香等专家担任农业科学观测实验站的站长，任期至2020年12月31日。

据悉，各实验室主任和实验站站长将按照《农业部办公厅关于公布“十三五”农业部重点实验室及科学观测实验站建设名单的通知》(农办科〔2016〕29号)要求，认真研究编制本实验室和实验站的建设任务书，明确建设内容和年度考核指标，加强对实验室和实验站的日常管理，扎实推进农业部重点实验室和农业科学观测实验站的建设工作，为提升农业科技自主创新能力做出积极贡献。各学术委员会主任则定期组织学术活动，指导监督重点实验室切实按照建设任务开展科研工作。（仪器信息网）

食药监总局印发食品快速检测方法评价技术规范

2015年新食品安全法出台，规定“采用快速检测方法对食品进行抽查检测，被抽查人对检测结果没有异议的，可以作为行政处罚的依据”，某种程度上给快检结论赋予了法律效力，由此催生食品快检行业及快速检测方法的高速发展。

2017年3月28日，为保证食品快速检测方法评价工作的科学性和规范性，食品药品监管总局组织制定了《食品快速检测方法评价技术规范》。这也意味着风头正劲的快检技术自此有了评价规范，变得有据可依。 （仪器信息网）

Determination of Water–Soluble Compounds in Black Tea by LC–IT–TOF MS Method

Yan Hongfei，Wang Meiling，Zou Can，Chen Lian，Lyu Xiaoyuan，Dai Jieyun
(Hunan Entry–Exit Inspection and Quarantine Bureau，State Key Laboratory of Food Safety Testing，Changsha 410004, China)

The liquid chromatography–ion trap time of flight mass spectrometry (LC–IT–TOF MS)method for rapid separation and identification of water–soluble components in Hunan dark tea was established. The samples of Hunan dark tea were extracted by hot water at 90℃. The water–soluble extracts were analyzed by liquid chromatography–ion trap time of flight mass spectrometry (LC–IT–TOF MS). The 43 compounds were isolated and identified simultaneously by using accurate mass matching and self-established mass spectrometry database combined with retention time，multiple-stage ion mass spectral，characteristic fragment ions. Through identification of the characteristic component of dark tea’s unique taste quality, a new technical means for Hunan dark tea quality evaluation and control was provided.

liquid chromatography–ion trap time of flight mass spectrometry; Hunan dark tea; water–soluble compound

657.7

A

1008–6145(2017)03–0022–05

湖南省科技计划项目(2015JC3128)

联系人：颜鸿飞；E-mail: yanhf@hnciq.gov.cn

2017–02–08

10.3969／j.issn.1008–6145.2017.03.005