抗生素效价测定仪校准用光谱中性滤光片的研制＊

丁峰元，雷军锋，杨占旗，班继民

(河南省计量科学研究院，郑州 450008)

抗生素效价测定仪校准用光谱中性滤光片的研制＊

丁峰元，雷军锋，杨占旗，班继民

(河南省计量科学研究院，郑州 450008)

根据浊度法抗生素效价测定仪吸光度的有效测量范围和液体培养基培养过程中吸光度逐渐降低的特点，选用中性灰色玻璃研制了吸光度标称值分别为0.3，0.5，0.7，1.0的光谱中性滤光片组标准物质。用紫外可见近红外分光光度计对研制的标准物质的均匀性、正反面和稳定性进行测试，吸光度均匀性最大值为0.002 0，吸光度正反面最大差值为0.000 4，吸光度稳定性最大值为0.002 5，符合二级标准物质要求，经评定标准物质吸光度的相对扩展不确定度为1%(k=2)。将该标准物质的定值结果与上一级计量标准中国计量科学研究院的校准结果进行比对验证，结果表明研制的标准物质定值准确，可用于抗生素效价测定仪吸光度准确性和溯源性校准。

光谱中性滤光片；标准物质；吸光度；抗生素效价测定仪

浊度法抗生素效价测定法自2005年在中国药典采用［1］，相关企业研制了浊度法抗生素效价测定仪。浊度法抗生素效价测定仪利用抗生素在液体培养基中对试验菌生长的抑制作用，通过测定培养后液体培养基吸光度值的大小，比较标准品与供试品对试验菌生长抑制程度，以测定供试品效价［2–3］，仪器的直接测量数据为吸光度。目前吸光度准确性和和溯源性一般采用光谱中性滤光片［4］，鉴于仪器比色皿的光程为20 mm，传统的光谱中性滤光片不适用于该仪器的校准［5］。笔者研制的光谱中性滤光片标准物质可用于校准抗生素效价测定仪，保证仪器吸光度量值准确可靠，填补了我国抗生素效价测定仪校准的空白。该滤光片标准物质由可见光区吸光度标称值分别为0.3，0.5，0.7，1.0的光谱中性滤光片组合而成，可对抗生素效价测定仪进行校准，使抗生素效价测定仪的校准工作规范化、实用化和可溯源性。

1 设计原理

根据《中华人民共和国药典(2015版)》的规定，浊度法抗生素测定需要的培养液体积为10 mL［2–3］，对应的浊度法抗生素测定仪的比色皿为长方体。比色皿外部长、宽均为22 mm，高为96 mm，内部长、宽均为20 mm，高为95 mm，即光程为20 mm。随着培养时间的变化，浊度法抗生素测定仪测定培养液的吸光度由高到低的变化，并将吸光度范围在0.3～0.7之间的测量数据作为抗生素效价计算的有效数据，其中吸光度测量波长点为单波长，选用波长为530 nm或580 nm［2–3］。针对以上特点，笔者研制了吸光度为0.3(用于校准有效测量数据低值准确性)、0.5(用于校准有效测量数据中值准确性)、0.7(用于校准有效测量数据高值准确性)、1.0(用于校准未加抗生素的对照样品吸光度准确性)的滤光片标准物质。本项目选择经有效溯源的紫外可见近红外分光光度计(Cary 5000型，美国安捷伦公司)对标准物质进行测量［6］，该仪器符合JJG 178–2007 的I级要求［7］，且技术指标也符合JJG 1034–2008对分光光度计的要求［8］。

2 制备工艺

2.1 原材料及加工工艺

光谱中性滤光片的原材料为中性灰色玻璃，该类玻璃以硼硅酸盐玻璃为基础玻璃，以铁、钴和镍等氧化物为着色剂，熔制成具有不同颜色深度的灰色玻璃，对整个可见光波段均匀吸收，可作为滤光片用于定量调节光的透过率［9］。分别选用牌号为ZAB50，ZAB30，ZAB20，ZAB10，对应的吸光度标称值分别为0.3，0.5，0.7，1.0，厚度2 mm的中性灰色玻璃，该玻璃在500～600 nm范围内吸光度光谱为平滑曲线(见图1)。每片滤光片切割成长58 mm，宽18 mm，并分别置于架体长22 mm，宽22 mm，高96 mm的滤光片支架上。共研制6套滤光片，编号分别为101～106，每套包含吸光度标称值为0.3，0.5，0.7，1.0的滤光片各1片，如101套内编号为101–0.3，101–0.5，101–0.7，101–1.0［10–11］。

图1 中性灰色玻璃吸光度谱图

2.2 滤光片均匀性测量

将滤光片垂直放置于光路上，光路经过滤光片正面中心点位置，以空气作参比，分别测定530 nm 和580 nm的吸光度，重复3次，取平均值。再将滤光片垂直放置于光路上，光路经过滤光片反面中心点位置，以空气作参比，分别测定530 nm和580 nm的吸光度值，重复3次，取平均值。另外在滤光片中心点位置的上、下各2 cm处，分别按照以上步骤进行测量。根据JJG 1034–2008规定，将滤光片上、中、下位置吸光度差值最大绝对值作为滤光片的均匀性测定结果［8］。

依据JJG 1034–2008对可见光区透射比标准滤光片计量性能的要求，一级滤光片的透射比均匀性＜0.1%。6套滤光片中各标称点吸光度均匀性最大值及其对应的透射比均匀性最大值见表1，均符合一级滤光片的要求［8］。

表1 6套滤光片各吸光度标称点均匀性最大值

2.3 滤光片正反面测量

将滤光片垂直放置于光路上，光路经过滤光片正面中心点位置，以空气作参比，分别测定530 nm 和580 nm的吸光度，重复3次，取平均值。再将滤光片垂直放置于光路上，光路经过滤光片反面中心点位置，以空气作参比，分别读取530 nm和580 nm的吸光度，重复3次，取平均值。根据JJG 1034–2008规定，正面吸光度平均值与反面吸光度平均值之差的绝对值为正反面吸光度差值［8］。

依据JJG 1034–2008对可见光区透射比标准滤光片计量性能的要求，一级滤光片的正反面透射比＜0.1%。6套滤光片中各标称点吸光度正反面差值最大值及其对应的透射比正反面最大值见表2，均符合一级滤光片的要求［8］。

2.4 滤光片稳定性测量

将均匀性、正反面差异性符合一级滤光片要求的滤光片依照JJG 1034–2008的测量方法，将每片滤光片在分光光度计上连续测量6次，取平均值作为该滤光片吸光度测量值，共监测12个月的滤光片吸光度稳定性。

表2 6套滤光片各吸光度标称点透射比正反面最大差值

依据JJG 1034–2008对可见光区透射比标准滤光片计量性能的要求，一级滤光片的年稳定性透射比＜0.1%，二级滤光片的年稳定性透射比＜0.3%。6套滤光片中各标称点吸光度年变化量最大值及其对应的透射比年变化量最大值见表3，均优于二级滤光片的要求［8］。

表3 6套滤光片各吸光度标称点透射比年稳定性最大值

3 定值结果的不确定度评定

对于光谱中性滤光片标准物质，其定值结果的不确定度主要由4部分组成：吸光度测量重复性引入的不确定度u1；标准物质均匀性引入的不确定度u2；标准物质稳定性引入的不确定度u3；定值仪器引入的不确定度u4［10–11］。

3.1 吸光度测量重复性引入的不确定度分量

用分光光度计连续测量6次滤光片的吸光度值，计算6次测量结果的标准偏差s，6次连续测量的平均值引入的不确定度相对不确定度u1r＝u1／A，结果见表4［6，12–13］。

表4 吸光度重复性测量结果及不确定度分量

3.2 标准物质均匀性引入的不确定度分量

对均匀性最大的滤光片进行不确定度评定，以101–0.3滤光片为例，其测量数据及不确定度评定见表5［6，12–13］。

表5 滤光片均匀性测量结果及不确定度分量

6套滤光片中各吸光度标称点最大均匀性引入的不确定度分量见表6。

表6 各吸光度标称点均匀性引入的不确定度分量

3.3 标准物质稳定性引入的不确定度

对稳定性变化最大的滤光片进行不确定度评定，测量数据及相对不确定度u3r结果见表7［6，12–13］。

表7 稳定性引入的不确定度分量评定结果

3.4 定值仪器引入的不确定度分量

JJG 1034–2008对滤光片定值所用分光光度计的特征波长点透射比最大示值误差要求为±0.1%，以均匀分布考虑，取则定值仪器透射比引入的不确定度分量见表8［6，12–13］。

表8 定值仪器引入的不确定度分量计算

3.5 合成不确定度

表9 不确定度分量及合成不确定度

3.6 扩展不确定度

取扩展因子为k=2，扩展不确定度Ur=kucr，结果见表10。将数据修约，取整数为1%，则光谱中性滤光片吸光度值的相对扩展不确定度为Ur=1%，k=2［6］。

表10 相对扩展不确定度

4 比对和验证

为了验证测量结果的准确程度，将编号为101的滤光片组进行测量后立即送至上一级计量标准单位(中国计量科学研究院)进行校准，将二者测量结果进行比对，结果见表11。由表11可知，吸光度差值均为0.000。经比对验证，滤光片定值结果与中国计量院的测量值一致，表明可以将定值结果作为标准值［14–15］。

表11 河南省计量院(HNIM)与中国计量院(NIM)测量值比对结果

5 结语

滤光片经正反面检测、均匀性检测、稳定性检测后，符合JJG 1034–2008 《光谱光度计标准滤光器》二级要求。将滤光片用经有效溯源且符合JJG 178–2007 《紫外、可见、近红外分光光度计》I级要求的Cary 5000型紫外可见近红外分光光度计进行定值，定值结果经比对验证后表明其定值结果准确可靠，符合二级标准物质要求。研制的光谱中性滤光片标准物质可用于抗生素效价测定仪的校准和溯源。

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Preparation of Reference Material for Spectral Neutral Filters to Calibrate Antibiotics Potency Analyzer

Ding Fengyuan, Lei Junfeng, Yang Zhanqi, Ban Jimin
(Henan Institute of Metrology， Zhengzhou 450008， China)

According to the characteristics with the absorbance measuring range and the absorbance decreasing in the cultivation process of the antibiotics potency analyzer，the reference materials of spectral neutral filters with absorbance nominal values of 0.3，0.5，0.7 and 1.0 were prepared by using neutral grey glasses. The absorbance homogeneity，directivity and stability of the reference materials were tested by using an ultraviolet visible near infrared spectrophotometer. The maximum absorbance homogeneity was 0.002 0，the maximum absorbance directivity was 0.000 4，and the maximum absorbance stability was 0.002 5，meeting the reference material 2nd level requirement. By evaluation，the relative expanded uncertainty of the reference material absorbance was 1%(k=2). The determination results of this reference material were compared with the calibration results of the previous level measurement standard (National Institute of Metrology , China)，the results validated that the absorbance of the reference material was accurate. The reference material can be used to calibrate the absorbance accuracy and traceability of antibiotics potency analyzer.

spectral neutral filter; reference material; absorbance; antibiotics potency analyzer

O657.3

A

1008–6145(2017)03–0010–04

*国家质检总局项目[(2014)79]；河南省重点科技攻关项目(122109000002)

联系人：丁峰元；E-mail: fengyuanding@163.com

2017–03–06

10.3969／j.issn.1008–6145.2017.03.002