中华鳖tyrp-1基因的生物信息学分析

王亚光，邵巧巧，孙冰冰，张耀红，管越强

(1.河北大学 生命科学学院，河北 保定 071002；2.保定水产技术推广站,河北 保定 071051)



中华鳖tyrp-1基因的生物信息学分析

王亚光1，邵巧巧1，孙冰冰1，张耀红2，管越强1

(1.河北大学 生命科学学院，河北 保定 071002；2.保定水产技术推广站,河北 保定 071051)

为阐明中华鳖酪氨酸酶相关蛋白1(TYRP-1)基因tyrp-1 及蛋白质结构与性质，利用相关软件、数据库和方法对其进行了生物信息学分析.结果显示，基因转录本全长为2 829 bp，编码535个aa. 预测TYRP-1蛋白分子质量为60.16 ku，理论等电点为5.35，为不稳定蛋白；N端含有信号肽，与信号识别蛋白结合后，促进其穿越内质网膜进入内质网腔；C端含有跨膜结构域，锚定于细胞膜上，发挥重要的生物学功能；TYRP-1蛋白含有2个铜离子结合结构域，与DCT蛋白有明显的相互作用.

中华鳖；tyrp-1基因；生物信息学

酪氨酸酶相关蛋白1(TYRP-1)基因tyrp-1是第1个被成功克隆的色素基因，是酪氨酸酶基因家族中的重要组成部分.酪氨酸酶相关蛋白1(EC:1.14.18.-)是黑色素合成途径中重要的酶，具有二羟基吲哚酸氧化酶的活性，可以催化5,6-二羟基吲哚羧酸(5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid, DHICA)氧化生成5,6-吲哚醌羧酸(indole-5,6-quinone-2-carboxylic acid)[1]. Zhao等[2]利用含有tyrp-1基因的逆转录载体转染人体TYRP-1蛋白缺陷的黑色素细胞，证明了外源的tyrp-1基因可以提高酪氨酸酶的活性. 因此，在维持酪氨酸酶的稳定性和调节催化活性中发挥了重要作用[3]. TYRP-1还在黑色素合成的下游途径中影响黑色素小体的成熟、黑色素瘤细胞的增殖和凋亡[4]. TYRP-1蛋白活性高低可影响真黑色素与伪黑色素合成转换，活性高时将生成真黑色素，活性降低时则生成伪黑色素[5].

中华鳖(Pelodiscussinensis)，隶属于爬行纲(Reptilia)龟鳖目(Testudoformes)鳖科(Trionychidae)鳖属(Pelodiscus)[6]，是中国重要的水产养殖品种，在南北方均有分布. 中华鳖体型椭圆，背部灰黑色带有花纹，腹部为白玉色. 近年来河北省保定市水产技术推广站、河北大学和保定市阜平县中华鳖养殖场等多家单位合作，通过人工选择育种技术繁育出体色金黄色的中华鳖，俗称“黄金鳖”. 通过对其裙边转录组数据进行分析，发现黄金鳖tyrp-1基因出现显著下调现象，该基因含有8个SNP位点，其中2个SNP位点分别位于第6和第8外显子上(数据未发表).

生物信息学是一门涵盖了计算机、数学、信息科学、生物学及统计学等多门学科的新型交叉学科[7]，通过对基因水平和蛋白水平的研究，来揭示基因、蛋白质的结构与功能、发育与疾病的关系[8]. 本文通过对中华鳖tyrp-1基因和TYRP-1蛋白质的生物信息学分析，探索黄金鳖体色的成因，为今后开展tyrp-1基因研究提供理论依据，同时也为中华鳖的遗传育种提供参考.

1 材料和方法

1.1 数据来源

中华鳖基因组序列来源于Ensembl(http://asia.ensembl.org/index.html)数据库，不同物种蛋白氨基酸序列来源于NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库.

1.2 方法

中华鳖tyrp-1基因的生物信息学分析包括基因序列分析、二级结构预测、三级结构预测、蛋白质的理化性质分析、亲/疏水性质分析、信号肽分析、跨膜结构域分析、铜离子结合结构域预测、相互作用蛋白分析等，所用数据库及软件见表1.

利用DNAMAN软件将中华鳖TYRP-1氨基酸序列与爬行纲(Reptilia)以及两栖纲(Amphibian)的其他物种进行比对，再利用Mega软件的邻接法构建系统进化树，通过重抽样检验拓扑树的各分节点，重复次数设置为1 000，并用bootstrap值估计各节点的支持率[9-10].

2 结果

2.1 中华鳖tyrp-1基因的特征分析

中华鳖tyrp-1基因(转录本ID为ENSPSIG00000012375)，位于JH207295.1负链的2 690 705～2 707 180 bp，基因组全长为16.5 kb，含有8个外显子，转录本全长为2 829 bp，编码535个aa(来源于Ensembl数据库).

2.2 中华鳖TYRP-1蛋白二级结构与铜离子结构域预测

通过NCBI数据库获得了中华鳖TYRP-1的氨基酸序列，利用Scratch protein predictor软件进行蛋白质二级结构的预测，结果显示，中华鳖tyrp-1基因共编码了535个aa，其中α-螺旋构象占29.1%，无规卷曲构象占64.9%，β-折叠构象占6.0%，无规卷曲构象所占比重较大，β-折叠构象所占比重最小. 利用Prosite软件对中华鳖TYRP-1蛋白进行铜离子结构域的预测. 可以看出：TYRP-1结构域与酪氨酸家族蛋白相似，包含有2个铜离子结合结构域，分别位于213～230位(氨基酸序列为HEGPAFLTWHRYHLLQLE)、395～406位(氨基酸序列为DPIFVFLHTFTD).

2.3 中华鳖TYRP-1蛋白三级结构和磷酸位点预测

Phyre2软件是通过折叠识别建模的方式进行蛋白质三级结构分析，为此本文利用该软件对中华鳖TYRP-1的三级结构进行预测(图1). 依据NetPhos 3.1软件分析可以得出：TYRP-1蛋白可能包含有49个磷酸化位点，位于丝氨酸残基上的有22个，位于苏氨酸残基上的有19个，位于酪氨酸残基上的有8个.

图1 中华鳖TYRP-1三级结构预测Fig.1 Tertiary structure prediction of TYRP-1 of Pelodiscus sinensis

2.4 中华鳖TYRP-1蛋白的基本性质分析

对中华鳖TYRP-1蛋白的理化性质、亲/疏水性、跨膜结构等基本特征进行预测，该分子质量约为60.16 ku，理论等电点为5.35，正电荷氨基酸残基数(Asp+Glu)为58，负电荷氨基酸残基数(Arg+Lys)为39，共含有8 280个原子，分子式为 C2668H4042N744O801S25.不稳定指数为49.75(>40表示该蛋白为不稳定蛋白)，说明该蛋白是不稳定蛋白.

根据Protscale软件预测中华鳖TYRP-1蛋白疏水性：位于第485位亲/疏水性分值最高，表明C端含有1个强的疏水区域；位于第81位的分值最低，表明N端含有1个强的亲水区域(图2). 结合ProtParam软件预测可知：中华鳖TYRP-1蛋白总平均亲水性为 -0.331，为疏水性蛋白.

图2 中华鳖TYRP-1蛋白亲水性预测Fig.2 Hydrophobicity profile prediction of TYRP-1 of Pelodiscus sinensis

2.5 中华鳖TYRP-1蛋白信号肽、亚细胞定位预测

利用SignalP-3.0软件的神经网络模型对中华鳖TYRP-1进行分析，第23位数值最大为0.911，该位点可能是信号肽的剪切位点，推测该蛋白存在信号肽，是分泌蛋白，信号肽剪切位点位于第22个和第23个aa位点之间. 利用隐马尔可夫模型同样预测出TYRP-1存在信号肽，预测的剪切位点位置与上述模型相同，存在可能性高达0.993，与神经网络模型预测结果相吻合. 上述2种信号肽预测模型结果相同，证实中华鳖TYRP-1存在信号肽，是一种分泌蛋白.

2.6 中华鳖TYRP-1蛋白跨膜结构预测

中华鳖TYRP-1蛋白第1～476位氨基酸位于细胞膜外，第477～499位氨基酸为跨膜结构域，第500～535位氨基酸位于细胞膜内，表明该蛋白定位于细胞膜(图3).

1.表示该段氨基酸序列位于细胞膜外；2.表示该段氨基酸序列为跨膜结构；3.表示该段氨基酸序列位于细胞膜内.图3 中华鳖TYRP-1蛋白的跨膜结构预测Fig.3 Transmembrane region prediction of TYRP-1 of Pelodiscus sinensis

2.7 中华鳖TYRP-1蛋白相互作用

利用String软件预测了与中华鳖TYRP-1相互作用的蛋白质，搜索条件限制在10个蛋白质，其中与酪氨酸酶相关蛋白2(DCT)的关系最密切(图4).

图4 中华鳖TYRP-1蛋白相互作用预测Fig.4 Protein-protein interactions prediction of TYRP-1 of Pelodiscus sinensis

2.8 中华鳖TYRP-1蛋白系统进化树分析

根据中华鳖及相关两栖、爬行动物TYRP-1序列，利用Mega软件的邻接法构建了系统进化树. 结果显示，两栖纲(Amphibian)的物种聚为一大支，爬行纲(Reptilia)的物种聚为一大支. 具体而言，中华鳖(P.sinensis)、绿海龟(Cheloniamydas)与锦龟(Chrysemyspicta)亲缘关系近，均为龟鳖目(Testudines)，在系统进化树中聚为一支；美洲短吻鳄(Alligatormississippiensis)和扬子鳄(Alligatorsinensis)均属于鳄形目(Crocodylia)鳄科(Crocodylidae)短吻鳄属(Alligator)，在进化树中聚为一支；北美绿蜥蜴(Anoliscarolinensis)和多疣壁虎(Gekkojaponicus)均属于蜥蜴目(Lacertiformes)，在进化树中聚为一支；普通束带蛇(Thamnophissirtalis)、原矛头蝮(Protobothropsmucrosquamatus)和缅甸蟒(Pythonbivittatus)均属于有鳞目(Squamata)，在进化树中聚为一支；大钝口螈(Ambystomamexicanum)和热带爪蟾(Xenopustropicalis)属于两栖纲(Amphibian)有尾目(Caudata)，在系统进化树中聚为一支(图5).

图5 中华鳖TYRP-1蛋白的系统进化树Fig.5 Phylogenetic tree of TYRP-1 of Pelodiscus sinensis

3 讨论

中华鳖tyrp-1基因是酪氨酸酶基因家族中的重要组成部分.本文利用生物信息学相关软件，对中华鳖tyrp-1基因的结构、性质和功能进行预测：中华鳖tyrp-1基因含有8个外显子，转录本全长为2 829 bp，编码535个aa，该蛋白的分子质量为60.16 ku，理论等电点为5.35，不稳定指数为49.75，是不稳定蛋白.

中华鳖TYRP-1蛋白是黑色素合成途径中重要的酶. 在N端含有1个信号肽，剪切位点位于第22和第23个氨基酸之间；C端的第477～499位的氨基酸是跨膜结构域. 这与张静等[11]研究鹅TYRP-1蛋白含有1个信号肽序列和1个跨膜结构域的结果相似. TYRP-1是一种分泌蛋白和膜糖蛋白，首先在细胞质内质网的核糖体上合成，经由内质网膜上的异位子改变其内腔结构，利用内质网伴侣蛋白以及相关酶进行折叠和装配，而后到达高尔基体，经过内体，最后转运到黑色素体膜上，并在黑色素体中发挥酶学催化作用[12-13].

中华鳖酪氨酸酶家族含有共同的结构域——铜离子结合结构域，在TYRP-1蛋白中共有2段，铜离子A结合位点位于213～230位(氨基酸序列为HEGPAFLTWHRYHLLQLE)，符合H-x(4,5)-F-[LIVMFTP]-x-[FW]-H-R-x(2)-[LVMT]-x(3)-E铜离子A结合位点通用公式，铜离子B结合位点位于395～406位(氨基酸序列为DPIFVFLHTFTD)，符合铜离子B结合位点通用公式：D-P-x-F-[LIVMFYW]-x(2)-H-x(3)-D. 酪氨酸酶家族铜离子结合结构域中，每一个铜离子都会受到3个保守的组氨酸残基的调控[14]. 铜离子与组氨酸配基结合，氧分子以过氧化物的形式与铜离子结合，行使二羟基吲哚酸氧化酶的功能，完成催化氧化反应.

在黑色素合成过程中，一些蛋白质与TYRP-1相互作用. String软件预测出与中华鳖TYRP-1相互作用的10个蛋白.其中，最重要的蛋白是DCT，它与TYRP-1相互作用，共同参与了黑色素生成调控过程，调节黑色素细胞发育生长和功能[15-17]. 与TYRP-1蛋白相互作用的CANX(钙连蛋白)是Ca2+连磷蛋白，位于内质网中，在特定条件下起到识别及与新蛋白特异性结合的作用[18]. CANX在TYRP-1蛋白折叠过程中可能起到分子伴侣作用[19].EDN3(内皮素3)对于毛色的作用越来越受到大家的关注. 王海东等[20]检测了不同体色的小鼠皮肤EDN3表达量，证明EDN3基因导致tyrp-1基因下调. 因此，tyrp-1基因在黑色素合成的过程中，与DCT 等上述蛋白质存在着相互作用.

通过对中华鳖TYRP-1蛋白的系统进化树分析，中华鳖(Pelodiscussinensis)、绿海龟(Cheloniamydas)和锦龟(Chrysemyspicta)亲缘关系近，均为龟鳖目(Testudines)，在系统进化树中聚为一支.

本文采用生物信息学方法分析了中华鳖酪氨酸酶相关蛋白1基因及蛋白质的结构与性质，可为研究TYRP-1在中华鳖黑色素合成途径中的重要作用提供重要的理论依据，有助于阐明黄金鳖体色发生机制，同时也可为中华鳖选择育种提供参考.

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(责任编辑：赵藏赏)

Bioinformatics analysis oftyrp-1 gene inPelodiscussinensis

WANG Yaguang1,SHAO Qiaoqiao1,SUN Bingbing1,ZHANG Yaohong2,GUAN Yueqiang1
(1.College of Life Sciences,Hebei University,Baoding 071002,China;2.Baoding Fishery Technology Extension Station,Baoding 071051,China)

In order to clarify the structure and characteristics of tyrosinase related protein 1(TYRP-1) in Chinese softshell turtlePelodiscussinensis, bioinformatics analysis was carried out using related softwares, databases and methods. The results showed that the transcript length oftyrp-1 gene was 2 829 bp, encoding a putative 535 aa. The deduced molecular weight of TYRP-1 protein was 60.16 ku and theoretical isoelectric point was 5.35, which indicated it was an unstable protein. A signal peptide domain was located in N-terminus, and it could bind to the signal recognition protein, leading the polypeptide chain through the endoplasmic reticulum membrane to the endoplasmic reticulum cavity. A transmembrane domain in the C-terminus, which anchored on the cell membrane, played an important biological function. The TYRP-1 protein contained two copper-binding domains, and interacted with DCT protein.

Pelodiscussinensis;tyrp-1 gene;bioinformatics

2016-06-15

河北省自然科学基金资助项目(C2016201207)；河北省现代农业产业技术体系淡水养殖创新团队项目

王亚光 (1990—)，男，山西平定人，河北大学在读硕士研究生.E-mail:1542120049@qq.com

管越强(1973—)，男，河北深泽人，河北大学教授，主要从事水生动物营养与免疫研究. E-mail：guanyueqiang@hbu.edu.cn

10.3969/j.issn.1000-1565.2017.03.009

S917.4

A

1000-1565(2017)03-0274-07