表面连接与核-壳型键合FITC荧光纳米硅球的制备及性能比较

蔡少凡，金秋，魏海英，吕运开

(河北大学 化学与环境科学学院，河北 保定 071002)



表面连接与核-壳型键合FITC荧光纳米硅球的制备及性能比较

蔡少凡，金秋，魏海英，吕运开

(河北大学 化学与环境科学学院，河北 保定 071002)

以异硫氰酸荧光素(FITC)为荧光分子，二氧化硅为生物相容性载体制备荧光纳米硅球.为增强硅球的稳定性，引入γ-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)做桥梁分子，由于FITC、SiO2与APTES连接顺序的非单一性，分别制备了表面连接型和核-壳型键合FITC的荧光硅球，并对其形貌和光漂白性进行了比较.实验结果表明，核-壳型和表面连接型荧光硅球形貌相似粒径接近，但表面连接型光漂白性严重.进而，对核-壳型中典型的包硅方法——Stöber法和反相微乳液法进行比较，结果表明，反相微乳液法制备的核-壳型键合FITC的荧光硅球荧光信号更强、粒径更小且分散性良好，同时在7 h内荧光染料泄漏程度小于8%，30 min内荧光强度仅降低2.2%，具备低染料泄露、光稳定性好等优点.

异硫氰酸荧光素(FITC)；荧光纳米硅球；光漂白；染料泄漏；光稳定

功能性微球通常是指具有一定功能的微纳米球，具有独特的比表面积大、扩散性和运动性好、凝集作用强等优点，且便于根据不同的用途而赋予各种性状，从而得到广泛应用[1].其中，荧光微球作为一种特殊的功能微球，因其稳定的形态结构及稳定而高效的发光效率等特点，越来越受到广大科研工作者的青睐[2-4].

异硫氰酸荧光素(FITC)是目前应用最广泛的荧光素，主要用于荧光抗体技术中，能和各种抗体蛋白结合，且结合后的抗体不丧失与一定抗原结合的特异性[5]，并在碱性溶液中具有强烈的绿色荧光，而人眼对黄绿色较为敏感，便于识别；在其表面包覆具有良好的生物相容性且表面羟基易修饰的硅胶载体，可大大增强其实用性[6-7].

倘若对FITC直接进行硅胶包覆，结构将不太稳定，易造成染料泄漏进而光漂白[8]，解决问题可以从合成方法入手.本文引入γ-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，利用其既含活性基团-NH2，又含Si—O—Si的特点，可将FITC和硅胶牢牢固定.由于FITC、SiO2与APTES连接顺序的非单一性，将会出现表面连接型(SiO2-APTES-FITC)和核-壳型(FITC-APTES-SiO2)2种结合可能，而这2种键合FITC的荧光硅球的性能如何尚不得而知；此外，制备核-壳型硅球时，经典的包硅方法有Stöber法[9-11]和反相微乳液法[8,12]，然而目前尚未有对这2种包硅方法所合成的荧光硅球性能进行详细比较的报道.基于键合FITC的荧光硅球在生物成像和靶向载药等方面的潜在应用，本工作分别制备了表面连接型和核-壳型键合FITC的荧光硅球，并通过FT-IR、SEM、EDS、紫外、荧光光谱等手段对所合成的荧光硅球的性能进行了较为详细的表征和比较，旨在通过以上的研究为制备性能优良的荧光纳米硅球提供有价值的信息.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

实验所用试剂均为分析纯：异硫氰酸荧光素(FITC)，γ-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，正硅酸乙酯(TEOS)，环己烷，正己醇，曲拉通114(Triton X-114)，无水乙醇，质量分数25%氨水，丙酮，体积分数95%乙醇，实验用水为去离子水.

TG328光学读数分析天平(湘仪天平仪器厂)，KH-250DE型数控超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)，台式离心机(上海安亭科学仪器厂)，电热真空干燥箱(湖北省黄冈市医疗器械厂)，F-380荧光分光光度计(天津港东科技发展有限公司)，傅里叶红外光谱仪(德国Bruker)，ZF-20D暗箱式紫外分析仪(巩义市予华仪器有限责任公司)，PhenomTM台式扫描电子显微镜(复纳科学仪器有限公司).

1.2 表面连接型键合FITC荧光纳米硅球的制备

1.2.1 氨基杂化硅球的制备

将无水乙醇、蒸馏水和氨水(质量分数25%)分别量取22.25，2.25和0.46 mL于100 mL圆底烧瓶中，充分搅拌均匀，逐滴滴加1.2 mL TEOS-APTES的混合溶液(体积比为5∶1)，磁力搅拌2.5 h.用体积分数95%乙醇超声洗涤数次，40 ℃真空干燥备用.

1.2.2 杂化硅球表面连接FITC

称取氨基杂化硅球0.15 g分散于500 μL的无水乙醇中，加入8 μL 40 mmol/L的FITC溶液，室温避光磁力搅拌2 h，搅拌速度约为200 r/min.用体积分数95%乙醇和蒸馏水交替洗涤数次，40 ℃真空干燥.

1.3 核-壳型键合FITC荧光纳米硅球的制备

1.3.1 FITC-APTES前驱体的制备

称取1 mg FITC，溶于1 mL 的无水乙醇，超声分散.然后加入5 μL APTES.在干燥密闭的氮环境中避光搅拌反应24 h，制得前驱体FITC-APTES.

1.3.2 FITC-APTES@SiO2核-壳纳米硅球的制备

1.3.2.1 反相微乳液法包覆硅壳 将环己烷、X-114和正己醇分别取7.5，1.77和1.8 mL混和，磁力搅拌30 min，缓慢滴加250 μL水，搅拌30 min使之混匀，形成清澈透明的微乳液.将150 μL 1 g/L FITC-APTES加入上述微乳液，充分搅拌混匀，依次加入100 μL的TEOS和60 μL质量分数 25% 氨水，室温避光磁力搅拌反应36 h后，加入少量丙酮破乳.分别用体积分数95%乙醇和蒸馏水洗涤，真空干燥，得到纯的FITC-APTES@SiO2核-壳型荧光纳米硅球.

1.3.2.2 Stöber法包覆硅壳 量取2.4 mL氨水(质量分数25%)和30 mL无水乙醇混合均匀后加入1.2 mL TEOS，搅拌5 min，然后加100 μL前驱体，室温避光磁力搅拌24 h.用体积分数95%乙醇和蒸馏水交替洗涤，真空干燥，制得纯的FITC-APTES@SiO2核-壳型荧光纳米硅球.

1.4 染料泄漏实验

将一定量荧光纳米硅球溶于去离子水中，超声，每隔1 h取出1 mL溶液，离心后弃去上清液，加入1 mL水；超声分散后用荧光分光光度计检测荧光强度，共测试7 h.通过荧光强度的变化确定有机荧光染料泄露的程度.

1.5 光稳定性实验

将1 mg荧光纳米硅球溶于2 mL乙醇溶液中，以150 W氙灯为激发光源，对溶液进行照射.每隔5 min测量1次最大发射波长处的荧光强度，共测试30 min.

2 结果与讨论

2.1 傅里叶红外光谱分析

对FITC、前驱体及3种不同方法制备的荧光硅球进行傅里叶红外光谱表征，结果如图1所示.

图1 (a) FITC、(b) FITC-APTES前驱体、(c)反相微乳液法、(e) Stöber法制备的核-壳型及(d)表面连接型荧光硅球FITC-APTES@SiO2的红外光谱Fig.1 Infrared spectra of FITC (a), FITC-APTES Precursors (b) and FITC-APTES@SiO2of surface connection type (d) and core-shell type prepared with the methods of Reverse microemulsion (c) and Stöber(e)

3 423.78 cm-1处既有FITC表面R—COOH的—OH伸缩振动振动峰，又有样品中残余水分的变形振动，在图1a-e中均出现，初步推测整个反应未破坏R—COOH结构，图1e的该处峰与其他4种物质相比明显得多，由于硅羟基具有亲水性，因此推测此现象可能由较厚硅层导致残余水分较多引起.在图1a中，2 031.72 cm-1为异硫氰根的C≡N伸缩振动峰，在图1b-e中消失，可推测前驱体制备过程中加成反应顺利进行，同时图1b中，在2 975.88 cm-1处出现-CH2-的伸缩振动峰，说明FITC与APTES成功连接.同时，在1 630.40 cm-1处的芳环羧酸的羰基(C=O)峰自始至终都没有消失，再次证明FITC和APTES是通过异硫氰键的加成共价结合在一起.在图1d中，3 198.12 cm-1为苯环的-CH=伸缩振动峰，而在图1c、e中均不明显，推测此峰为氨基杂化硅球表面接枝的FITC引入，可初步证明表面接枝FITC成功.由图1c-e可见，在1 092.72 cm-1和467.28 cm-1左右的强吸收峰是Si—O—Si特征峰，可证明反相微乳液法和Stöber法包硅成功，此外，图1e处的1 092.72 cm-1和467.28 cm-1峰均比图1c-d的明显，可再次证明用Stöber法包硅，硅层较厚.

2.2 能谱分析

为了探究表面连接型荧光硅球的合成情况，对氨基杂化硅球和表面连接型荧光硅球进行了能谱表征，如图2所示.氨基杂化硅球(a)的能谱表征中N元素质量分数为4.5%，可见，在合成过程中，APTES与TEOS进行了完美融合，将氨基接枝入硅球中形成杂化硅球.表面连接型荧光硅球(b)的N元素质量分数是8.5%，较(a)有所增加，可推测荧光染料在杂化硅球外面接枝成功.

图2 (a)氨基杂化硅球、(b)表面连接型荧光硅球的能谱分析Fig.2 EDS spectrum of amino hybrid silicon microspheres (a) and fluorescent silicon microspheres of surface connection type (b)

2.3 荧光纳米硅球的紫外分析

使用ZF-20D暗箱式紫外分析仪对表面连接型及反相微乳液法、Stöber法制备的核-壳型荧光硅球进行紫外照射，结果如图3所示.

异硫氰酸荧光素在紫外灯照射下呈现出明显的黄绿色荧光，由图3可知，反相微乳液法(a)和stöber法(b)制备的核-壳型荧光硅球在254 nm紫外灯下发出黄绿色特征荧光，而表面连接型(c)荧光硅球则无明显变化.推测反相微乳液法和Stöber法制备的核-壳型荧光硅球中，荧光染料外面包覆的硅壳可很好地阻止荧光染料的泄漏和漂白，而表面连接型荧光硅球的荧光染料暴露在硅壳表面，易受外界影响从而削弱其荧光信号.

2.4 荧光光谱分析

分别将表面连接型、反相微乳液法及Stöber法制备的核-壳型荧光硅球均匀分散在无水乙醇中，进行荧光光谱性质的测定，结果如图4所示.在492 nm的150 W氙灯激发下，反相微乳液法(a)、Stöber法(b)制备的核-壳型和表面连接型(c)键合FITC的荧光硅球在527 nm处均有较明显的峰型显示，而表面连接型荧光硅球(c)在527 nm处的峰强最弱，进而说明表面连接型荧光纳米硅球荧光信号最弱，被漂白严重，此结果与2.3中紫外分析结果一致，从而再次证明荧光染料外面包覆硅壳的优越性.

2.5 扫描电子显微镜分析

为了探究不同方法制备的键合FITC荧光纳米硅球尺寸大小及形貌，用扫描电子显微镜(SEM)进行表征，结果如图5.由图5可知，反相微乳液法(a)、Stöber法(b)制备的核-壳型和表面连接型(c)荧光硅球尺寸分布较均匀，分散性良好，平均粒径分别为177、445、159 nm.

图3 (a)反相微乳液法、(b) Stöber法制备的核-壳型及(c)表面连接型荧光硅球在254 nm紫外照射(左)前(右)后对比Fig.3 Comparison of fluorescent silicon microspheres of the surface connection type (c) and core-shell type prepared with the methods of Reverse microemulsion (a) and Stöber (b) between before (left) and after (right) UV irradiation

图4 (a)反相微乳液法、(b) Stöber法制备的核-壳型及(c)表面连接型荧光硅球的荧光光谱Fig.4 Fluorescence spectra of fluorescent silicon microspheres of the surface connection type (c) and core-shell type prepared with the methods of Reverse microemulsion (a) and Stöber (b)

图5 (a)反相微乳液法、(b)Stöber法制备的核-壳型及(c)表面连接型荧光硅球的扫描电子显微镜图像Fig.5 SEM images of fluorescent silicon microspheres of the surface connection type (c) and core-shell type prepared with the methods of Reverse microemulsion (a) and Stöber (b)

2.6 反相微乳液法制得的荧光硅球的基本性能表征

2.6.1 荧光光谱表征

分别将FITC和反相微乳液法制得的荧光硅球均匀分散在无水乙醇中，进行荧光光谱性质的测定，结果如图6所示.游离的FITC (a)在无水乙醇溶液中的荧光激发波长为492 nm，荧光发射峰在525 nm，实验结果表明，荧光纳米硅球的荧光激发峰的位置与形状，与FITC相比基本保持不变，但是发射峰的位置略有红移(527 nm)，SiO2基质与染料相互作用，会引起能量的损失，导致荧光发射峰红移.

2.6.2 染料泄漏值及光稳定性测定

实验发现，FITC在以APTES为桥梁下能稳定存在于SiO2网络中.将经过乙醇和水洗涤后的纳米硅球分散到二次蒸馏水中，7 h内荧光染料泄漏程度小于8%，如图7(左)所示.同时还考察了荧光纳米硅球的光漂白行为，以150 W的氙灯为激发光源，经过30 min的连续照射后发现，荧光纳米硅球的荧光强度降低2.2%，如图7(右)，荧光信号基本保持不变，这是由于硅壳的保护作用，说明键合FITC荧光纳米硅球光稳定性良好.

3 结论

以氨基硅烷做桥梁分子，利用其氨基可与异硫氰酸荧光素(FITC)的异硫氰基(-N=C=S)加成连接，氨基硅烷可与正硅酸乙酯(TEOS)的硅羟基共价结合的特点，将FITC稳固地键合在硅胶中.核-壳型与表面连接型键合FITC的荧光纳米硅球形貌相似、粒径接近，但表面连接型荧光硅球光漂白性严重.反相微乳液法制备的核-壳型荧光纳米硅球比Stöber法粒径更小且易控，荧光信号更强，染料泄漏低，光稳定性良好.因此反相微乳液法为上述多种方法中最佳，其制备的键合FITC的荧光纳米硅球有望在药物标记、传输、检测、高通量药物筛选及生物成像、传感等领域广泛应用.

图6 (a) FITC (b) FITC-APTES@SiO2的荧光光谱图Fig.6 Fluorescence spectra of FITC(a) and FITC-APTES@SiO2 (b)

图7 FITC-APTES@SiO2的(左)染料泄漏曲线与(右)光稳定曲线Fig.7 Dye leakage curve (left) and light stabilization curve (right) of FITC-APTES@SiO2

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(责任编辑：梁俊红)

Preparation and characterization comparison of FITC bonded fluorescent silica nanospheres with surface connection type and core-shell type

CAI Shaofan,JIN Qiu,WEI Haiying,LÜ Yunkai
(College of Chemistry and Environmental Science,Hebei University,Baoding 071002,China)

Silica fluorescent nanoparticles were prepared with fluorescein isothiocyanate (FITC) as the fluorescent molecule and silica as the biocompatible carrier.To enhance the stability of the microspheres,the bridge molecule (γ-aminopropyl triethoxysilane,APTES) was introduced.Owing to the non-unity of the connection sequences of FITC,SiO2with APTES,two types (surface connection type and core-shell type) of FITC bonded fluorescent silica nanospheres were prepared and compared in their morphologies and photobleachings.The results show that both types had similar morphology,but the surface connection type was optically bleached seriously.Furthermore,two typical methods of packaging silicon (Stöber and reverse microemulsion) were compared.Core-shell FITC bonded fluorescent silica nanospheres preparaed by reverse microemulsion method showed stronger fluorescence signal,and had smaller particle size and better dispersibility.In addition the value of fluorescent dye leak was less than 8% within 7 h in the dye leakage experiment and the fluorescence intensity decreased only 2.2% within 30 min in light stability experiment,which showed the low dye leakage degree and good light stability properties.

fluorescein isothiocyanate (FITC);fluorescent silica nanospheres;photobleaching;dye leakage;light stability

2016-08-03

河北省自然科学基金资助项目(B2016201213)

蔡少凡(1991—)，女，河南漯河人，河北大学在读硕士研究生，从事荧光功能微球的研究. E-mail:csfan0906@126.com

魏海英(1977—),女，河北邯郸人，河北大学副教授，博士，主要从事功能MOFs材料研究. E-mail:weihy@hbu.cn

10.3969/j.issn.1000-1565.2017.03.005

O613.7

A

1000-1565(2017)03-0248-06