兔出血症病毒特异性核酸适配体的筛选

焦美会，刘家森，姜 骞，陆涛峰，胡小亮，蒋艳妹，曲连东

（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室，哈尔滨 150001）

·研究论文·

兔出血症病毒特异性核酸适配体的筛选

焦美会，刘家森，姜 骞，陆涛峰，胡小亮，蒋艳妹，曲连东

（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室，哈尔滨 150001）

为筛选出兔出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）衣壳蛋白VP60特异性核酸适配体，建立新型的兔出血症（rabbit hemorrhagic disease，RHD）检测方法，本研究构建了一个长80 nt的随机寡核苷酸文库。以固定在PVDF膜上的VP60为靶分子，使用消减SELEX技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment）进行20轮的筛选，以生物素标记的次级文库作为“一抗”，以辣根过氧化物酶标记的链酶亲和素作为“二抗”，对文库进行Western blot鉴定，结果表明第20轮文库存在可特异性的识别VP60的核酸序列。随机选取第20轮文库的46条序列克隆、测序，得到20个高度同源序列，同时对46个适配体再次鉴定，最终得到3个特异性识别VP60的适配体。

兔出血症病毒；适配体；SELEX技术

兔出血症（rabbit hemorrhagic disease，RHD）俗称兔瘟，是由兔出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）引起的一种急性、败血性、接触性传染病。RHDV主要感染成年兔和2月龄以上的青年兔，病死率达90%以上，爆发时可引起兔大量死亡，兔群数量急剧下降[1,2]，因此RHD是兔的一种毁灭性传染病[3]。RHDV为单股正链RNA病毒，属杯状病毒科、兔病毒属[4,5]。RHD可以根据RHDV流行病学特点、病理学变化进行初步诊断，进一步确诊则需实验室诊断。目前多采用人的“O”型红细胞凝集试验检测，但有时会产生假阳性或假阴性，降解后的病毒颗粒也不能被检测出；电镜法通过对典型病毒形态的观察来判断，主观性强；RT-PCR方法用于病毒的核酸检测，灵敏度较高；免疫学方法包括AGP、ELISA、Western blot、ISH等都需要抗体，成本较高，且各个实验室使用的抗体不够统一规范。

适配体是由20~80个核苷酸组成的单链DNA或RNA，能够形成特定的空间结构与蛋白特异性结合。与抗体相比，适配体在医学应用领域有许多优势:灵敏度高、特异性强、制备方便、成本低、便于保存运输，无免疫原性，易在体外化学合成[6]，一致性和重复性好，因此可代替抗体应用于诊断、治疗、传感器[7-9]等多个领域。适配体在生物医学诊断和疾病治疗等领域发挥着越来越重要的作用。目前有些病毒的适配体已被筛选到，如人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）等，但关于RHDV的适配体研究尚未见报道。VP60是RHDV的主要结构蛋白，具有较好的免疫原性，是检测首选抗原。本研究首次以VP60为靶标分子，采用消减的SELEX技术，经过20轮筛选，得到了能特异性结合VP60的3条寡核苷酸序列，为RHDV的诊断和治疗提供了新的思路。核苷酸文库（ssDNA），文库长度40 nt，文库两端设计固定序列，相应设计3条引物（表1），文库及引物均由哈尔滨博仕生物公司合成。

1.3 靶蛋白VP60和消减蛋白BSA的固定 将纯化的RHDV (血凝价HA:27）经SDS-PAGE电泳，转膜（PV DF），2% BSA封闭，取小部分膜以1D6 （1:2000）为一抗进行Western blot鉴定，DAB显色确定V P60位置，将剩余的膜上对应的部分剪下备用。 BSA经SDS-PAGE部分胶电泳，取部分进行考马斯亮蓝染色，其余部分转膜。根据考马斯亮蓝染色结果，确定BSA在PVDF膜上位置，剪下备用。

表1 文库及引物Table 1 Oligonucleotide library and primers

1.4 第一轮筛选 1 OD初始文库溶解于130 μ L binding buffer（1×PBS，1 mmol/L MgCl2），至终浓度为10 pmol/μ L。筛选前文库95℃加热5 min，冰浴10 min。将含VP60的膜与文库4℃相互作用1.5 h，binding buffer洗膜3次，每次5 min。加入100 μ L ddH2O，95℃作用10 min，洗脱产物转移至新的离心管中，获得第一轮特异性的ssDNA，-20℃备用。

1.5 ssDNA文库的获得 通过优化PCR反应条件将洗脱产物扩增并进行胶回收，以dsDNA为模板，作不对称PCR，Primer1和Primer2 比例分别为10:1、20:1、30:1、50:1、80:1、100:1。经12% 7 mol/L尿素变性PAGE胶电泳确定最佳比例并大量扩增，使用Dr.Gen TLE Precipitation Carrier沉淀产物得到ssDNA（步骤详见TaKaRa说明书），溶于适量的binding buffer， -20℃保存备用。

1.6 适配体反复筛选 适配体第二、三轮筛选步骤同1.4。第四轮开始每一轮筛选前先用BSA消减文库。将处理好的文库与含BSA的膜37℃作用60 min，再与含VP60的膜37℃作用1.5 h；binding buffer洗膜3次，每次5 min，加入100 μ L ddH2O，95℃作用10

1 材料和方法

1.1 毒株、抗体和试剂 RHDV HY D株（GenBank登录号：JF412629）由本实验室于病死兔肝脏组织中纯化获得；RHDV鼠源单克隆抗体1D6由本实验室制备保存；HRP标记的山羊抗鼠IgG购自中杉金桥；PV DF膜购自Millipore公司；Mini BEST胶回收试剂盒、pMD18-T V ector、DNA沉淀剂Dr. Gen TLE Precipitation Carrier均购自TaKaRa公司；Streptavidin-HRP 购自CST公司。

1.2 文库及引物 设计并体外化学合成初始随机寡聚

min，洗脱产物转移至新的离心管中。获得的每轮洗脱产物作为模板得到dsDNA时都要对PCR反应条件进行优化，共进行了20轮筛选。

1.7 亚型文库的鉴定 以20轮dsDNA为模板，引物Primer3和 Primer2进行不对称PCR，获得生物素标记的ssDNA文库。先将空白的PV DF膜与处理的文库37℃作用1 h；将含BSA和V P60的PV DF膜与文库37℃作用2 h，洗膜；HRP标记的链霉亲和素（1:2000）与膜37℃作用1 h，洗膜，DAB显色，设置以1D6为一抗的阳性对照，同时设置BSA为对照蛋白。

1.8 适配体的克隆分析和测序 将20轮dsDNA连接到pMD18-T载体上并转化至E.coil DH5α感受态中，挑取46个适配子克隆测序。通过Western blot对46个适配子识别VP60蛋白情况进行鉴定，正常兔的肝脏组织蛋白和BSA蛋白为对照。使用DNAMAN软件对适配子序列比对分析，同时通过mfold网站（http:// unafold.rna.albany.edu/?q=mfold）对鉴定呈阳性的适配子进行二级结构分析。

2 结果

2.1 不对称引物PCR优化 不对称PCR产物经12% 7 mol/L尿素PAGE胶电泳，结果显示引物比例为30:1时最佳（图 1）。

图1 不对称PCR的引物比例优化Fig. 1 Optimizing result of asymmetric PCR primer ratioM: DNA分子量标准(DL2000); 1~6: 引物比例分别为10:1、20:1、30:1、50:1、80:1、100:1M: DNA Marker(DL2000); 1-6: Primer ratio were 10:1, 20:1, 30:1, 50:1, 80:1, 100:1, respectively

2.2 亚型文库的鉴定 通过Western blot鉴定20轮ssDNA文库对靶蛋白VP60的特异性，DAB显色结果表明，在60 kDa处有特异性的显色条带，且与阳性对照组一致（图2）。

图2 20轮亚型文库的鉴定Fig.2 Identification of ssDNA of 20 roundsM: 蛋白质分子量标准; 1: 阳性对照; 2: 20 轮 ssDNA; 3: 空白对照（BSA）M: Protein Marker; 1: Positive control; 2: 20 rounds ssDNA; 3: Negative control(BSA)

2.3 适配体的克隆、测序和鉴定 经DNAMAN比对发现，46条序列中17、41号适配子序列完全相同，有20条适配子都含有相似性很高的序列。46条序列中1、12、26号适配子（表2）对RHDV VP60蛋白显色结果为阳性，正常兔肝脏组织蛋白、BSA均无显色条带（图3），通过mfold网站（http://unafold.rna. albany.edu/?q=mfold）对这3个适配子的二级结构进行预测分析，发现这些序列虽然二级结构不同，但都含茎环结构，因此推测该茎环结构为适配体特异性识别VP60的基本结构（表3）。

3 讨论

SELEX技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment）又称指数富集配体系统进化技术，是近年来备受关注的一种体外筛选技术，通过该技术可以筛选得到与蛋白、核酸、氨基酸等各种靶分子具有高亲和力、高特异性结合的寡核昔酸序列。利用该技术已经筛选到多种病毒的适配子，有些已经被应用于诊断、治疗等领域。

本研究将高纯度的RHDV衣壳蛋白VP60固定在PVDF膜上，通过免疫检测、裁切，获得了高纯度的固相化蛋白。由于靶蛋白VP60固定时为变性状态，因此我们筛选的适配体针对的是变性的VP60。本研究设计并合成了一个长为80 nt的单链DNA随机寡核苷酸文库，中间为随机序列，是形成茎环、扭结、凸起和伪结[10]等二级结构或三级结构的关键序列。筛选中通过不断改变筛选的温度、靶物质及文库的浓度以及作用时间等工作条件，并以BSA蛋白作为消减蛋白，消减非特异性适配体分子。Western blot鉴定结果表明第20轮文库能够识别并特异性结合靶蛋白。选取46条序列克隆、测序，并通过生物信息学技术分析，结果显示第20轮次级文库已经得到富集，将46条适配子进行单独扩增，并经Western blot鉴定，1、12、26这三个适配子能特异性识别RHDV V P60蛋白，对正常兔肝脏组织蛋白及BSA不能识别。通过Mfold网站对适配子进行结构预测，结果表明，三个适配体均有茎环结构，我们推测该结构可能是适配子与V P60特异性结合的基础。本研究首次利用RHDV VP60为靶分子筛选出3条特异性适配体，为探索RHDV的新的诊断和治疗方法提供了基础。

表 2 适配子序列Table 2 Sequences of aptamers

图3 20轮适配子的鉴定Fig.3 Identification of aptamer of 20 roundsM: 蛋白质分子量标准; 1: 阳性对照; 2~4: 1号适配子分别针对VP60蛋白、肝脏组织蛋白和BSA检测; 5~7: 12号适配子适配子分别针对VP60蛋白、肝脏组织蛋白和BSA检测; 8~10: 26号适配子适配子分别针对VP60蛋白、肝脏组织蛋白和BSA检测M: Protein Marker; 1: Positive control; 2-4: Aptamer 1 againt VP60, liver protein and BSA, respectively; 5-7: Aptamer 12 againt VP60, liver protein and BSA, respectively; 8-10: Aptamer 26 againt VP60, liver protein and BSA, respectively

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表 3 适配子二级结构模拟图Table 3 Analysis of the secondary structure of the aptamers with Mfold software

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SCREENING OF SPECIFIC APTAMERS FOR RABBIT HEMORRHAGIC DISEASE VIRUS

JIAO Mei-hui, LIU Jia-sen, JIANG Qian, LU Tao-feng, HU Xiao-liang, JIANG Yan-mei, QU Lian-dong
(State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology, Harbin Veterinary Research Institute, CAAS, Harbin 150001, China)

In the present study, a random oligonucleotide library (80 nt) was constructed to select the aptamers against capsid protein VP60 of Rabbit hemorrhagic disease virus (RHDV) and develop a new diagnostic method. Post SDS-PAGE separation, protein VP60 was transferred onto PVDF membranes. After 20 rounds of screening, the secondary library was obtained, whose affinity and specificity were detected by using biotin-labeled aptamers as the primary antibody and HRP-streptavidin as the secondary antibody. The results showed that VP60 was identified by biotin-labeled subordinated library. In conclusion, the recombinant plasmids were cloned, sequenced, detected and eventually three specific nucleotide sequences were obtained.

Rabbit hemorrhagic disease virus; aptamers; SELEX

S852.659.6

A

1674-6422（2017）02-0009-05

2016-12-09

中国农业科学院创新团队科研项目

焦美会，女，硕士研究生，预防兽医学专业

曲连东，qld@hvri.ac.cn；刘家森，neauljs@163.com