日本血吸虫重组蛋白Sj22.6、LHD-Sj23、2LHD-Sj23的表达和抗原性比较

付 媛，石团员，蒲克俊，舒琦艳，卢福庄，帅江冰，张雪娟，莫虹斐，杨富文，何永强

（1.浙江省农业科学院畜牧兽医研究所，杭州 310021；2.浙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心，杭州310016；3.兰州工业研究院，兰州 730050）

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日本血吸虫重组蛋白Sj22.6、LHD-Sj23、2LHD-Sj23的表达和抗原性比较

付 媛1，石团员1，蒲克俊3，舒琦艳1，卢福庄1，帅江冰2，张雪娟1，莫虹斐2，杨富文1，何永强2

（1.浙江省农业科学院畜牧兽医研究所，杭州 310021；2.浙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心，杭州310016；3.兰州工业研究院，兰州 730050）

日本血吸虫（Schistosoma japonicum，Sj）膜相关蛋白Sj22.6和Sj23大亲水区多肽（LHD- Sj23）都具有良好的抗原性，可用于日本血吸虫病的免疫学诊断。本研究通过RT-PCR技术扩增了Sj22.6和LHD-Sj23基因片段，重叠延伸PCR方法融合了2个LHD-Sj23的片段，构建了pET28-Sj22.6、pET28-LHD-Sj23以及pET28-2LHD-Sj23原核表达质粒，在大肠杆菌（Transetta DE3）中表达，获得了rSj22.6、rLHD-Sj23和r2LHD-Sj23三种重组蛋白。用Dot-ELISA方法检测牛日本血吸虫阴阳性血清各10份，比较其敏感性和特异性，结果表明rLHD-Sj23具有较好的效果，为进一步研究利用重组蛋白进行血吸虫血清学诊断奠定基础。

日本血吸虫；Sj 22.6; LHD-Sj 23; 2LHD-Sj 23；斑点酶联免疫吸附试验

日本血吸虫病是由日本血吸虫（Schistosoma japonicum）寄生于宿主门静脉系统血管内引起的，能导致肝脏虫卵结节、肝脏肿大、腹腔积液的一种危害严重的人畜共患寄生虫病，流行于我国长江流域[1]。患病家畜是我国血吸虫病的主要传染源[2-4]。2014年以来，控制传染源是我国血吸虫病防控的主要策略。家畜血吸虫病的诊断在血吸虫病防控中具有重要地位。免疫学诊断是防控日本血吸虫病的重要手段之一，但其特异性较低，主要原因是目前所用的诊断抗原大多数是虫卵可溶性抗原，抗原组分复杂，与其它蠕虫的诊断具有交叉反应。近年来，人们发现利用血吸虫基因重组抗原诊断血吸虫病时，敏感性与血吸虫虫体、虫卵抗原相似，且易于制备和纯化。现已有多种血吸虫的基因被克隆表达，应用于家畜血吸虫病诊断[5-9]。

日本血吸虫的膜相关蛋白Sj22.6和Sj23存在于曼氏血吸虫和日本血吸虫的童虫和成虫表膜[10-12]，Sj22.6和Sj23大亲水区多肽LHD-Sj23具有良好的反应原性[12-17]。本研究分别表达了日本血吸虫膜蛋白Sj22.6和LHD-Sj23，并对不便于表达和纯化的短片段LHD-Sj23进行融合表达，通过DOT-ELISA方法对3种重组蛋白的诊断潜力进行筛选，为选择更优良的日本血吸虫免疫学诊断抗原提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 载体、菌株、重组蛋白、虫株和血清 pET-28a(+)原核表达载体、大肠杆菌DH5α为本实验室保存；大肠杆菌Transetta（DE3）感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司（TransGen Biotech）；克隆载体pMD18-T购自宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa）；日本血吸虫虫株来自浙江省医学科学院；人工感染血吸虫黄牛45天血清和阴性血清由本室收集并保存；rGST-Sj22.6蛋白由本室表达纯化保存。

1.1.2 工具酶、主要试剂和仪器 小量质粒抽提试剂盒、DNA 胶回收试剂盒和Trizol购自上海生物工程生物技术有限公司；DNA Marker、限制性内切酶及连接酶购自TaKaRa 公司；蛋白质Marker为Fermentas

公司产品；亲和层析Ni-NTA A rgrose Beads为Invitrogen公司产品；RT－PCR试剂盒和硝酸纤维素膜为Promega公司产品；HRP标记兔抗牛IgG为美国KPL公司产品；PCR仪为PTC-200核酸扩增仪。

1.2 方法

1.1.1 引物设计与合成 根据Genbank上已公布的日本血吸虫Sj22.6和LHD-Sj23基因序列，参照文献[6，7]，用Primer Primier 5.0软件辅助设计扩增日本血吸虫膜蛋白Sj22.6和LHD-Sj23 基因的PCR引物对F2/R2 和F3/ R3，引物LR和LF中插入柔性连接，以引物对F3/LR和LF/R3分别扩增单个LHD-Sj23，以单个片段为模板，引物对F3/R3扩增融合片段2LHD-Sj23，引物序列见表1。Sj22.6、LHD-Sj23和2LHD-Sj23基因片段的上游引物含有EcoR I限制性酶切位点，下游引物序列含有Sal I酶切位点。

1.2.2 反转录PCR 扩增Sj22.6、LHD-Sj23和2LHDSj23 DNA片段 取日本血吸虫虫体100 mg，按照Trizol试剂操作说明提取总RNA，用对应的引物对扩增Sj22.6、LHD-Sj23、2LHD-Sj23基因序列。3个基因片段反转录条件相同：70℃ 5 min，42℃60 min，94℃ 2 min，反应产物作为模板进行PCR反应。扩增Sj22.6基因序列PCR反应条件：94℃30 s→56℃ 30 s→72℃ 30 s，32个循环后72℃延伸10 min，4℃保存。扩增LHD-Sj23基因序列PCR反应条件：94℃ 30 s→55℃ 30 s→72℃ 30 s，32个循环后72℃延伸10 min，4℃保存。以引物对F3/LR和LF/ R3分别扩增单个LHD-Sj23，扩增条件同上，产物等量混合稀释100倍后作为模板，以F3/R3为引物，扩增融合片段2LHD-Sj23反应条件：94℃ 30 s→56℃ 1 min→72℃ 1 min，32个循环后72℃延伸10 min，4℃保存。产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 pET28-Sj22.6、pET28-LHD-Sj23以及pET28-2LHD-Sj23原核表达质粒的构建 将PCR产物从0.8%琼脂糖凝胶上回收，具体操作按照胶回收试剂盒说明进行。回收产物和载体pET28a（+）、分别用EcoR I和Sal I限制性内切酶双酶切后胶回收，回收产物Sj22.6、LHD-Sj23和2LHD-Sj23基因片段与pET28a（+）载体连接，将连接产物转化大肠杆菌DH 5α感受态细胞，提取质粒，用EcoR I和Sal I进行双酶切鉴定。鉴定正确的质粒送至上海英骏生物科技公司测序，测序结果与理论拼接序列比对分析。

表1 PCR引物的名称和序列Tab 1 Names and sequences of PCR primers

1.2.4 pET28-Sj22.6、pET28-LHD-Sj23以及pET28-2LHD-Sj23原核表达质粒在大肠杆菌Transetta （DE3）中的表达及表达条件的优化 将测序正确的重组质粒pET28-Sj22.6、pET28-LHD-Sj23以及pET28-2LHD-Sj23分别转化大肠杆菌 Transetta （DE3），诱导表达程序按照pET 系统操作手册进行蛋白质电泳（SDS-PAGE）分析。将正确表达菌株37℃振荡培养至对数生长期, 加入IPTG至终浓度为0.8 mmol/L进行诱导，分别在37℃诱导0、0.25、0.5、1、2、3、4、5、6 h以及30℃诱导6 h后，分别取菌液进行SDS-PAGE分析。

1.2.5 表达产物的纯化 分别取大量诱导表达后菌液100 mL，4℃、8000×g离心5 min，4℃收集菌体，称重后加入细胞裂解液，并用超声裂解菌体收集包涵体蛋白。蛋白纯化按照纯化操作手册，于Ni-NTA亲和层析柱中纯化，收集纯化的rSj22.6、rLHDSj23和r2LHD-Sj23，PBS透析脱盐处理后经SDSPAGE鉴定纯度。

1.2.6 Dot-ELISA对重组蛋白特异性的比较 将纯化好的重组蛋白rSj22.6、rLHD-Sj23和r2LHD-Sj23分别稀释至1 mg/mL，取1μ L重组蛋白点，在硝酸纤维素膜上，自然干燥后，5%脱脂奶粉封闭过夜。以标准牛阳性血清10份，阴性血清10份作为一抗1:100稀释，37℃ 孵育1 h；辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗牛IgG抗体作为二抗1:5000稀释，37℃ 孵育1 h，以DAB为底物室温显色5 min。

2 结果

2.1 日本血吸虫Sj22.6、LHD-Sj23和2LHD-Sj23 基因克隆 以日本血吸虫成虫虫体总RNA为模板，RTPCR扩增Sj22.6和LHD-Sj23基因序列，PCR产物经凝胶电泳成像鉴定可见扩增出长度为576、195、408 bp的条带（图1）。

2.2 表达质粒pET28-Sj22.6、pET28-2LHD-Sj23以及pET28-LHD-Sj23的构建及酶切鉴定 以EcoR I和Sal I双酶切Sj22.6、LHD-Sj23和2LHD-Sj23 PCR产物，分别与酶切好的pET28a（+）表达载体连接，转化至E. coli DH5α感受态细胞，小量提取重组质粒pET28-Sj22.6 、pET28-2LHD-Sj23以及pET28-LHD-Sj23用EcoR I和Sal I双酶切鉴定后，分别可见目的片段。双酶切鉴定正确的质粒测序结果与理论拼接序列比对分析，表明基因片段LHD-Sj23和2LHD-Sj23与已公布的血吸虫基因序列100%同源，片段Sj22.6与已公布的安徽的血吸虫基因相比对有3个碱基突变，144处的G突变成A引起氨基酸序列48处天冬氨酸突变成天冬酰胺，其他两处都为同义突变。结果表明原核表达质粒pET28-Sj22.6、pET28-LHD-Sj23以及pET28-2LHD-Sj23构建成功。

2.3 重组蛋白诱导表达、表达条件优化及蛋白纯化将阳性表达菌株pET28-Sj22.6/Transetta（DE3）、pET28-2LHD-Sj23/ Transetta（DE3）以及pET28-LHD-Sj23/ Transetta（DE3）经IPTG诱导后的菌液进行SDS-PAGE分析，可见约26、18、10 kDa的融合蛋白（图3），与预计表达蛋白的分子量大小相符（表1），而未诱导菌液没有相应的蛋白表达条带。

经SDS-PAGE分析表明，重组蛋白rSj22.6、rLHD-Sj23和2LHD-Sj23主要以包涵体的形式存在。表达条件优化后阳性表达菌pET28-Sj22.6/ Transetta（DE3）在37℃经0.8 mmol/L IPTG诱导3 h，重组蛋白Sj22.6可获得大量表达。pET28-2LHD-Sj23/ Transetta（DE3）在37℃经0.8 mmol/L IPTG诱导5 h，重组蛋白2LHD-Sj23可获得大量表达。pET28-LHD-Sj23/ Transetta（DE3）在37℃经0.8 mmol/L IPTG诱导5 h，重组蛋白GST-LHD-Sj23可获得大量表达。在最佳条件下扩大培养，收集菌体，获得纯化后的重组蛋白rSj22.6、rLHD-Sj23和r2LHD-Sj23（图3）。

2.4 Dot-ELISA对重组蛋白的特异性比较结果 3种纯化的重组抗原rLHD-Sj23、rSj22.6、r2LHD-Sj23与标准牛阴、阳性血清各10份的Dot-ELISA结果如表2，检测结果表明，rLHD-Sj23阴、阳性血清检出率较高，r2LHD-Sj23次之，rSj22.6检出率较低。

3 讨论

图2 重组蛋白Sj22.6, LHD-Sj23 和2LHD-Sj23 的表达Fig.2 Expression of Sj22.6, LHD-Sj23 and 2LHD-Sj23 expression by SDS-PAGEM: 蛋白质分子量标准; 1,3,4,6,7: pET28a/Transetta (DE3)空载体对照; 2: pET28-Sj22.6/Transetta (DE3)表达菌株; 5: pET28-LHD-Sj23/ Transetta (DE3)表达菌株; 8: pET28-2LHD-Sj23/ Transetta (DE3)表达菌株M: Protein Marker; 1, 3, 4, 6, 7 : The negative control of pET28a/ Transetta (DE3); 2: pET28-Sj22.6/Transetta (DE3); 5: pET28-LHD-Sj23/ Transetta (DE3); 8: pET28-2LHD-Sj23/ Transetta (DE3)

图3 三种纯化重组蛋白SDS-PAGE电泳图Fig.3 Identification of three purified recombinant protein by SDS-PAGEM: 蛋白分子量标准; 1: 重组蛋白2LHD-Sj23; 2: 重组蛋白Sj22.6; 3: 重组蛋白LHD-Sj23M: Protein Marker, 1: r2LHD-Sj23; 2:rSj22.6; 3: rLHD-Sj22.6

表2 重组抗原Dot-ELISA结果Tab 2 Dot-ELISA results of three recombinant proteins

膜相关蛋白Sj22.6 是由Stein等[8]从曼氏血吸虫cDNA文库中筛选出来，并证实其编码蛋白分子存在于童虫和成虫表膜，膜相关蛋白Sj23全长片段不易原核表达，而LHD-Sj23具有良好的免疫反应性，同时可作为疫苗候选分子[7,9]。本研究成功表达了日本血吸虫的3种重组蛋白rLHD-Sj23、rSj22.6和r2LHDSj23，为了明确3种重组融合蛋白抗原性的优劣，进而筛选具有日本血吸虫免疫诊断价值的重组抗原，我们采用简便、快速、易操作的Dot-ELISA方法，抗原性以rLHD-Sj23为最佳，为筛选合适的重组抗原并建立免疫学诊断方法奠定了基础。但本研究标准血清样本量还太少，需要后续增加样本量进行进一步验证。

有研究表明，日本血吸虫的重组抗原中LHDSj23具有更好的反应原性，并且已应用于牛、羊的日本血吸虫病血清学诊断[3,10,11]，上述研究采用LHD-Sj23和血吸虫GST蛋白融合表达，获得一定的协同效果。本研究原核表达了LHD-Sj23，根据软件计算该包括融合标签的重组蛋白理论大小约有10.4 kDa。因短片段的肽段不利于纯化和后续操作，本研究利用重叠延伸PCR技术将2段LHD-Sj23基因片段进行融合，以期获得更好的反应原性。但Dot-ELISA数据表明2个相同片段的融合并没有产生明显的抗原反应性优势，这可能是由于纯化的rLHDSj23蛋白纯度更高，研究结果还需要通过ELISA等其他方法进一步验证。

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EXPRESSION AND ANTIGENICITY TESTING OF RECOMBINANT PROTEINS SJ22.6, LHD-SJ23 AND 2LHD-SJ23 OF SCHISTOSOMA JANPONICUM

FU Yuan1, SHI Tuan-yuan1, PU Ke-jun3, SHU Qi-yan1, LU Fu-zhuang1, SHUAI Jiang-bing2, ZHANG Xue-juan1, MO Hong-fei2, YANG Fu-wen2, HE Yong-qiang1
(1. Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China; 2. Technology Center of Zhejiang Entry-Exit Inspection and Quarantine, Hangzhou 310021, China; 3. Lanzhou Industry Research Institute, Lanzhou 730050, China)

The membrane-associated proteins Sj22.6 and LHD-Sj23 (large hydrophilic region polypeptide) of Schistosoma japonicum have been shown good antigenicity and used as antigens for the immunological diagnosis of schistosomiasis. In the present study, Sj22.6 and LHD-Sj23 gene fragments were amplified in RT-PCR and 2LHD-Sj23 fragments was amplified in overlapping PCR. Prokaryotic expression plasmids pET28-Sj22.6, pET28-LHD-Sj23 and pET28-2LHD-Sj23 were constructed and expressed in E. coli (Transetta DE3). Three recombinant proteins rSj22.6, rLHD-Sj23 and r2LHD-Sj23 were obtained and tested in Dot-ELISA using positive and negative bovine antisera of schistosomiasis. The results showed that rLHD-Sj23 possessed a better sensitivity and specificity than others. The present study provided preliminary research on recombinant proteins as serological diagnostic antigens for bovine schistosomiasis.

Schistosoma japonicum; Sj22.6; LHD-Sj23; 2LHD-Sj23; Dot-ELISA

S852.735

A

1674-6422（2017）02-0072-05

2016-08-04

浙江省科技计划项目（2009C12057）；国家质量监督检验检疫总局科技项目（2008IK027）；浙江出入境检验检疫局重点科技项目（2013-ZKZ-02）

付媛，女，助理研究员，主要从事寄生虫病诊断及寄生虫分子生物学研究

何永强，E-mail：hyq@ziq.gov.cn