应用Cre/loxp系统构建含有BAC序列的重组伪狂犬病毒

王 涛，童 武，叶 超，于之清，梁 超，李国新，高 飞，单同领，于 海，郑 浩，童光志

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

·研究论文·

应用Cre/loxp系统构建含有BAC序列的重组伪狂犬病毒

王 涛，童 武，叶 超，于之清，梁 超，李国新，高 飞，单同领，于 海，郑 浩，童光志

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

近年来我国出现伪狂犬病毒变异株，导致猪伪狂犬病重新爆发流行。为研究伪狂犬病毒变异株毒力增强与抗原变异的分子机制，需要建立该病毒的感染性克隆操作系统。本研究通过构建转移载体pTEGGF，利用同源重组将含有增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）表达框及两翼各一个loxp位点，插入到伪狂犬病毒变异株PRV JS-2012 gG编码区下游，获得重组病毒rJS2012-gG/EGFP。将表达Cre重组酶的质粒pcDNA3.1-Cre转染BHK-21细胞，再感染rJS2012-gG/ EGFP，筛选获得含有单一loxp位点的重组病毒rJS2012-gG/loxp。将rJS2012-gG/loxp基因组、含有EGFP标记基因的BAC载体pBeloBAC11-EGFP和pcDNA3.1-cre共转染BHK-21，获得含有BAC序列插入的重组病毒rJS2012-BAC。一步生长曲线与空斑试验显示，重组病毒rJS2012-BAC在体外生长略慢于亲本病毒。本研究成功构建了含有BAC载体的重组伪狂犬病毒，为进一步建立伪狂犬病毒变异株的感染性克隆操作系统，开展变异株的分子病原学研究打下良好基础。

伪狂犬病毒变异株；细菌人工染色体；Cre/loxp系统

伪狂犬病（pseudorabies，PR）是由伪狂犬病毒（Pseudo rabies virus，PRV）感染多种家畜与野生动物后出现以发热、奇痒、呼吸和神经系统症状为特征的急性传染病[1]。PR曾在世界范围内广泛传播，只有部分欧美国家宣布在家猪中根除了该病，但在野猪中仍有流行[2]。多年来，通过免疫接种，PR在我国得到了有效控制。然而自2011年底以来，中国数十省相继爆发PR并呈流行扩大趋势。研究表明，我国出现了伪狂犬病毒变异株，导致猪伪狂犬病重新爆发流行。与经典毒株相比，变异株抗原性存在差异，毒力明显增强，基因序列存在不同程度改变，现有疫苗不能提供有效保护[3-6]。

疱疹病毒细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome，BAC）技术是将BAC载体插入疱疹病毒基因组中，提取病毒复制过程中的环状基因组电转化入大肠杆菌DH10B中，筛选出包含病毒全基因组的阳性克隆[7]。利用该技术既可以使疱疹病毒在大肠杆菌中稳定的增殖、保存，也可以在细菌中对其基因组任意基因进行缺失、替换、突变等遗传操作[8]。BAC突变技术已经成为疱疹病毒分子病原学研究的重要工具[9]。Cre/loxp系统由Cre重组酶和loxp位点两部分组成，在Cre重组酶的作用下可以将设定的DNA片段删除、倒位、以及定点整合[10]。由于该系统作用方式简单高效，被广泛应用在删除特定基因、外源基因整合、动植物体内外DNA重组等领域，已成为体内外遗传操作新的有力工具[10]。

本研究以我国目前流行的PRV变异株为研究对象[11]，利用Cre/loxp位置特异性重组系统，将BAC载体序列重组入变异株JS-2012中，为构建变异株感染性克隆操作系统奠定了基础，为进一步研究变异株抗原变异、毒力增强的分子机制提供技术支持。

1 材料和方法

1.1 病毒和细胞 伪狂犬病毒变异株PRV JS-2012为中国农业科学院上海兽医研究所猪病研究室（以下简称本实验室）分离鉴定并保存[11]；BHK-21细胞、Vero细胞均为本实验室保存。

1.2 质粒和菌株 pBeloBAC11载体与大肠杆菌DH10B由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所王云峰研究员惠赠；pcDNA3.1-Cre购自和元生物技术（上海）股份有限公司；pEGFP-N1、pEGFP-C3购自Clontech公司；pMD18-T、大肠杆菌DH5α购自TaK aRa公司。

1.3 工具酶和主要试剂 限制性内切酶和T4 DNA L igase购自NEB公司；FuGENE 6转染试剂购自Promega公司；胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）和DMEM购自Gibco公司；质粒小提试剂盒购自QIAGEN公司；质粒中提试剂盒购自Macherey-Nagel公司；凝胶回收试剂盒购自广州东盛生物科技有限公司；PCR 试剂购自TaKaRa 公司。

1.4 引物设计 根据已发表的PRV JS-2012基因组序列（GenBank登录号：KP257591.1），按照US4 (gG)至US6(gD)基因区间序列，设计2对扩增左右同源臂引物：PgGF/PgGR、PDgGF/PDgGR；根据pEGFP-C3载体序列设计扩增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）表达盒的引物pEGFPF/pEGFPR；根据PRV JS-2012 gG基因序列设计loxp插入测序检测引物gLoxF/gLoxR。引物均由 Invitrogen上海公司合成，序列见表1。

1.5 转移载体构建

1.5.1 转移载体pT EGGF构建 首先使用X ho I和BamH I酶切pEGFP-C3，并用T4 DNA polymerase补平，胶回收大片段并以T4 DNA Ligase连接，获得了删除X ho I至BamH I间多克隆位点序列的质粒PEGFP-C3D。以PRV JS-2012基因组为模板，使用引物PgGF/PgGR和PDgGF/PDgGR分别扩增左右侧同源臂，并将扩增产物连接入pMD18-T，获得重组质粒pGL-ARM 和pGR-ARM。利用Sac I和Ase I酶切pGL-ARM、Ase I和Xba I酶切pEGFP-C3D，回收小片段，以T4 DNA Ligase连接入经Sac I和Xba I酶切的pBlueScript SK(+)，获得重组质粒pLARM-EGFP。以Afl II和EcoR I分别酶切pGR-ARM和pEGFP-N1，将从pEGFP-N1切下的polyA片段连接入pGRARM，获得重组质粒pRARM-PA。以Xho I和Xba I酶切pRARM-PA，回收小片段，以T4 DNA Ligase连入经相同酶酶切的pLARM-EGFP，获得了转移载体pTEGGF。

1.5.2 转移载体pBeloBAC11-EGFP构建 以pEGFP-C3D为模板使用引物pEGFPF/pEGFPR扩增EGFP表达盒，回收目的条带。以BamH I和Hind III分别酶切PCR条带和pBeloBAC11，并以T4 DNA Ligase将EGFP表达盒与pBeloBAC11连接。连接产物转化DH5α，以BamH I和Hind III酶切筛选阳性克隆，获得转移载体pBeloBAC11-EGFP。

表 1 本研究所用到的引物Table 1 Primers used in this study

1.6 重组病毒构建

1.6.1 重组病毒rJS2012-gG/EGFP的构建 将PRV JS-2012接种BHK-21细胞，待70%病变时刮取细胞。使用酚/氯仿抽提法提取PRV JS-2012基因组并测其浓度，使用FuGENE 6转染试剂将2μ g PRV JS-2012基因组与1μ g pTEGGF 质粒共转染BHK-21细胞。待细胞病变达到60%时，收上清进行空斑纯化。挑取有绿色荧光的单个病毒空斑，获得含有EGFP和2个loxp位点插入的重组病毒（图1b），命名为rJS2012-gG/EGFP。

1.6.2 重组病毒rJS2012-gG/loxp的构建 利用FuGENE 6将2μ g表达Cre重组酶的质粒pcDNA3.1-Cre转染BHK-21细胞。转染10 h后，以0.01 MOI重组病毒rJS2012-gG/EGFP进行感染。待出现70%细胞病变，收上清进行空斑纯化。挑取没有绿色荧光的单个病毒空斑，获得不表达EGFP的重组病毒，命名为rJS2012-gG/loxp（图1c）。利用引物gLoxF/gLoxR检测重组病毒是否删除EGFP及一个loxp位点。

1.6.3 重组病毒rJS2012-BAC的构建 使用FuGENE 6转染试剂将2μ g pBeloBA C11-E GFP、1μ g pcDNA3.1-cre、1μ g rJS2012-gG/loxp基因组共转染BHK-21细胞，待出现70%细胞病变时，收上清进行空斑纯化。挑取有绿色荧光的单个病毒空斑，进行纯化获得BAC载体插入的重组病毒，命名为rJS2012-BAC（图1d）。图1表示重组病毒构建过程。

图1 重组病毒构建过程示意图Fig.1 Schematic diagram of the steps for constructing the recombinant virus

1.7 重组病毒一步生长曲线 以1MOI的rJS2012-gG/ EGFP、rJS2012-gG/loxp、rJS2012-BAC与亲本毒PRV JS-2012分别接种T25中的Vero细胞，37℃孵育1 h后，DMEM洗2遍，加入5 mL含2% FBS的DMEM。分别于接种后4、8、12、16、20、24、28、32、36、40 h取培养上清500μ L，并补加500μ L含2%FBS的DMEM。将不同时间点的病毒10倍梯度稀释成10-1至10-9的稀释度，并接种到生长于96孔细胞培养板中的单层Vero细胞，每个稀释度接8

孔。接种细胞培养4 d后，观察每孔的细胞病变，按照 Reed-Muench 法计算病毒TCID50，利用GraphPad软件绘制病毒一步生长曲线。

1.8 重组病毒空斑实验 将重组病毒rJS2012-gG/ EGFP、rJS2012-gG/loxp、rJS2012-BAC与亲本毒PRV JS-2012分别使用DMEM培养基稀释后，接种Vero细胞，孵育1 h后，弃去病毒液，PBS洗2次，每孔加入3 mL含有1%低熔点琼脂糖和2% FBS的覆盖培养基。室温凝固后，于37℃、5% CO2中倒置培养3 d后，用5%的结晶紫染色即可观察空斑大小。

2 结果

2.1 转移载体构建及鉴定 提取转移载体pBeloBAC11 -EGFP 和pTEGGF 的质粒，1%琼脂糖凝胶电泳结果如图2。测序结果显示，2个转移载体与预期一致。以FuGENE 6将2 μ g pBeloBAC11-EGFP 和pTEGGF分别转染BHK-21细胞，转染24 h后观察，均有绿色荧光产生（图3）。

图2 转移载体琼脂糖凝胶电泳结果

Fig.2 Identification of transfer plasmids by agarose gel electrophoresis

1:转移载体pBeloBAC11-EGFP; 2: 转移载体pTEGGF; M: DNA分子量标准(DL15000)

1: Transfer vector pBeloBAC11-EGFP; 2: Transfer vector pTEGGF; M: DNA Marker (15000)

2.2 重组病毒筛选及纯化 将PRV JS-2012基因组与转移载体pTEGGFF 共转染BHK-21细胞，产生的病毒经过连续5轮挑取表达绿色荧光的单个空斑进行纯化，获得重组病毒rJS2012-gG/EGFP。将rJS2012-

图3 转移载体转染BHK-21细胞Fig.3 Transfection results of the transfer plasmids in BHK-21 cellsA: 转移载体pTEGGF; B: 转移载体pBeloBAC11-EGFP; C: 阴性对照A: Transfer vector pTEGGF; B: Transfer vector pBeloBAC11-EGFP; C: Negative control

gG/EGFP接种转染表达Cre重组酶质粒的BHK-21细胞，收获的病毒经过连续4轮挑取无绿色荧光的单个空斑进行纯化，获得了重组病毒rJS2012-gG/loxp。以gLoxF/gLoxR为引物（表1）进行PCR检测，扩增的片段测序分析显示，在rJS2012-gG/loxp基因组中，loxP位于gG基因终止密码子下游（图4），与预期一致。将pcDNA3.1-Cre、pBeloBAC11-EGFP和重组病毒rJS2012-gG/loxp共转染，挑取有绿色荧光的单个空斑传代纯化，经过6轮纯化获得重组病毒rJS2012-BAC。各重组病毒在Vero细胞中的荧光表达如图5所示。

2.3 重组病毒一步生长曲线 将重组病毒rJS2012-gG/ EGFP、rJS2012-gG/loxp 和rJS2012-BAC与亲本毒PRV JS-2012接种Vero细胞，测定不同时间点的病毒滴度绘制的一步生长曲线如图6。结果显示，感染早期，rJS2012-gG/EGFP与PRV JS-2012滴度相近，rJS2012-gG/loxp与rJS2012-BAC滴度相近，但rJS2012-gG/EGFP与PRV JS-2012的滴度高于rJS2012-gG/loxp与rJS2012-BAC的滴度。从12 h开始3个重组病毒的滴度接近，复制速度差异不明显。重组病毒的复制速度虽略微低于亲本毒，但与亲本毒一致均在32 h时达到最高滴度，且滴度接近。随后所有病毒滴度均开始下降，但亲本毒略高于重组病毒。

图4 loxp位点检测结果Fig.4 The sequencing results of loxp site

图5 重组病毒及亲本毒感染Vero细胞荧光表达结果Fig. 5 Fluorescent expression of recombinant viruses in Vero cells infected with recombinant virus and parental virus PRV JS-2012

图6 重组病毒与亲本毒一步生长曲线Fig.6 Single-step growth curves of the recombinant viruses and parental virus PRV JS-2012 in Vero cell

2.4 重组病毒空斑大小和形态 将重组病毒rJS2012-gG/EGFP、rJS2012-gG/loxp、rJS2012-BAC与亲本毒PRV JS-2012感染V ero细胞，加1%琼脂层培养60 h后，以结晶紫进行染色。重组病毒与亲本毒空斑形态如图7，rJS2012-gG/EGFP和rJS2012-gG/loxp空斑大小相似, 与亲本毒PRV JS-2012相比，略小于亲本毒，而rJS2012-BAC空斑则更小。这表明gG编码框下游插入序列，对重组病毒在细胞间扩散存在影响，而长序列，如BAC载体序列，的插入影响更为明显。

3 讨论

图7 重组病毒与亲本毒空斑形态Fig.7 Plaque morphology of the recombinant virus and parental virus PRV JS-2012A: 亲本毒PRV JS-2012; B: 重组病毒rJS2012-gG/EGFP; C: 重组病毒 rJS2012-gG/loxp; D: 重组病毒rJS2012-BACA: Parental virus PRV JS-2012 ; B: Recombinant virus rJS2012-gG/EGFP; C: Recombinant virus rJS2012-gG/loxp; D: Recombinant virus rJS2012-BAC

1999年PRV BAC（pBecker1）首次构建成功，该研究将F质粒插入PRV-Becker gG基因上游，pBecker1虽然可以在大肠杆菌中稳定增殖，但是转染真核细胞后发现F质粒的部分序列会有自发删除现象[12]。彭金美等[13]将BAC 质粒插入PRV 弱毒疫苗株Bartha K61的 TK基因中，成功的获得了带 BAC质粒的重组伪狂犬病毒 rv-PRVBAC，该重组病毒可以在Vero细胞中稳定遗传。尹文玲等[14]将BAC载体插入PRV TK基因内完成了猪伪狂犬病毒浙江株感染性细菌人工染色体的构建。为了不破坏PRV基因组中任何基因的结构，我们将BAC载体的插入位点选在了gG基因编码区下游，从而保证伪狂犬病毒变异株基因组的完整性，降低了对PRV其他基因功能研究时的潜在影响。

构建PRV细菌人工染色体大多通过一步同源重组，将带有标记基因的BAC载体插入PRV基因组中，筛选出包含完整PRV基因组的阳性克隆[12-14]。一步同源重组的优点是通过一次重组多轮空斑筛选纯化，即可获得重组病毒。本研究利用Cre/loxp系统位置特异性、重组效率高的特点[10]，通过多次重组构建了含有BAC载体序列的重组PRV。本研究先通过EGFP标记筛选将loxp位点引入重组病毒，再利用Cre/loxp系统将大片段BAC载体引入重组病毒中，虽然步骤较多，但每步获得阳性重组病毒的几率高，获得含BAC载体的重组病毒也易于实现。同时，后期也可以利用Cre/loxp系统删除插入的BAC载体获得PRV突变毒无痕恢复株，更有利于PRV变异株的分子病原学研究。

从病毒的生长特性来看，在gG编码框下游插入序列的重组病毒的生长动力学与亲本株PRV JS-2012相似，但最高滴度比亲本株低。重组病毒的空斑都比亲本株的偏小，特别是有长片段BAC载体插入的重组病毒空斑偏小更为明显。这表明，gG编码框下游插入序列，特别是BAC载体，对病毒生长存在一定影响。但在重组病毒的设计中，含BAC载体的重组病毒同时携带loxp序列，可以利用Cre/loxp系统删除病毒中BAC载体序列，以消除BAC载体对病毒的影响。

本研究利用Cre/loxp系统构建了含有BAC载体序列的重组病毒，为建立PRV变异株的感染性克隆操作系统奠定了良好基础。

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CONSTRUCTION OF A RECOMBINANT PSEUDORABIES VIRUS CARRYING A BAC SEQUENCE BY USING CRE/LOXP SYETEM

WANG Tao, TONG Wu, YE Chao, YU Zhi-qing, LIANG Chao, LI Guo-xin, GAO Fei, SHAN Tong-ling, YU Hai, ZHENG Hao, TONG Guang-zhi
(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

To develop a reverse genetic system for Pseudorabies virus (PRV), a recombinant PRV carrying a BAC sequence was constructed in the present study. An EGFP expression cassette flanked by a loxp site in both sides was inserted into the downstream of gG coding region of a pseudorabies virus variant strain PRV JS-2012 by homologous recombination, generating a recombinant virus rJS2012-gG/EGFP. BHK-21 cells were transfected with the pcDNA3.1-Cre that expressed Cre recombinase and then infected with rJS2012-gG/ EGFP. A recombinant virus rJS2012- gG/loxp carrying only one loxp site downstream of gG coding region was obtained. Subsequently, the genome of rJS2012-gG/loxp was co-transfected with pcDNA3.1-cre and pBeloBAC11-EGFP into BHK-21 cells, generating a recombinant virus rJS2012-BAC. The recombinant virus rJS2012-BAC carried the BAC vector sequences in its genome and grew slightly slower than its parent strain JS-2012 in vitro. The availability of the recombinant virus rJS2012-BAC would contribute to developing a reverse genetic system for PRV.

Pseudorabies virus variant strain; bacterial artificial chromosome; Cre/loxp syetem

S852.659.1

A

1674-6422（2017）02-0022-07

2016-10-30

国家重点研发计划项目(2016YFD0500100)；上海市科技兴农重点攻关项目(沪农科攻字(2016)第4-2号)

王涛，男，硕士研究生，预防兽医学专业

童光志，E-mail：gztong@shvri.ac.cn；郑浩，E-mail：haozheng@shvri.ac.cn