抗PUF60抗体在系统性红斑狼疮中的分布及临床意义

张亚妹，彭清林，卢 昕，杨阚波，4，尹利国，石景丽，陈 贺，4，王国春⋆

（1.北京大学中日友好临床医学院，北京 100029；2.中日友好医院临床研究所，北京 100029；

3.中日友好医院 风湿免疫科，北京 100029；4.中国医学科学院北京协和医学院 研究生院，北京 100730）

抗PUF60抗体在系统性红斑狼疮中的分布及临床意义

张亚妹1，2，彭清林2，卢 昕3，杨阚波2，4，尹利国1，2，石景丽1，2，陈 贺2，4，王国春3⋆

（1.北京大学中日友好临床医学院，北京 100029；2.中日友好医院临床研究所，北京 100029；

3.中日友好医院 风湿免疫科，北京 100029；4.中国医学科学院北京协和医学院 研究生院，北京 100730）

目的：检测系统性红斑狼疮（SLE）患者血清中抗PUF60抗体水平，探讨该抗体阳性的SLE患者的临床和实验室特征。方法：选取我院收治的SLE患者104例和健康对照163名。采用ELISA法测定上述人群血清中抗PUF60抗体，部分抗体阳性血清采用免疫印迹法进一步验证。结果：血清抗PUF60抗体在SLE中的阳性率为17.3%（18/104）。抗PUF60抗体阳性的SLE患者发病年龄[21（18，27）岁]低于抗体阴性组[29（20，37）岁]（P= 0.007），脱发的发生率[72.2%（13/18）]高于抗体阴性组[40.7%（35/86）]（P＜0.05）。抗PUF60抗体阳性组中补体C4降低、外周血B1细胞数目升高的患者比例和抗dsDNA抗体、抗Sm抗体及抗SSB抗体的阳性率显著高于抗PUF60抗体阴性组（P＜0.05）。结论：本研究首次对我国SLE患者血清中抗PUF60抗体进行检测，发现抗PUF60抗体是SLE的相关性抗体，该抗体阳性者具有独特的临床表型。

系统性红斑狼疮；自身抗体；抗PUF60抗体

Author’s addressChina-Japan Friendship School of Clinical Medicine，Peking University，Beijing 100029，China

系统性红斑狼疮 （systemic lupus erythemato- sus，SLE）是自身免疫病的原型，临床表现多样，并具有复杂的免疫学异常。多种自身抗体的产生是SLE免疫学异常的主要特点，其可通过细胞介导及免疫复合物形成等途径造成多器官、多系统的损害[1]。抗核抗体（antinuclear antibodies，ANAs）可见于95%以上的SLE患者，其中抗双链（ds）DNA抗体 （anti-double-stranded DNA antibody）和抗Sm抗体（anti-smith antibody）是SLE的标志性抗体。小分子核糖核蛋白颗粒 （small nuclear ribonucleoprotien particle，snRNP）是ANAs的重要靶抗原之一，也是剪接体的主要构成组分。PUF60（poly-U-binding factor 60 kDa）蛋白是剪接体中U2snRNP的剪接因子，由559个氨基酸残基组成，可诱导自身抗原表位扩展，激发免疫反应[2]。Livia等人研究发现，在干燥综合征及高加索皮肌炎患者中均可检测到抗PUF60抗体的存在[3]。为了解抗PUF60抗体是否存在于SLE患者中及其可能的临床意义，本文检测了该抗体在我国SLE患者中的表达情况并分析其临床相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料

（1）系统性红斑狼疮组：选2011年11月~ 2015年8月于中日友好医院住院治疗的SLE患者104例；男10例、女94例；年龄10~74岁，平均（35±14）岁；诊断符合1997年美国风湿病学会（ACR）修订的SLE分类（诊断）标准。所有入选病例均排除合并其他自身免疫病。（2）健康对照组：选取我院门诊体检的健康者163名；男20名、女143名；年龄21～57岁，平均（38±10）岁，性别和年龄均与SLE组相匹配。所有血清采集分离之后冻存于-80℃直至检测时使用。本研究已通过我院伦理委员会批准（批准文号2013-6），所有受试者签署知情同意书。

1.2 ELISA法检测血清抗PUF60抗体

（1）包被：将商品化的重组PUF60蛋白（Origene，TP323492）用0.05M pH9.6碳酸盐包被缓冲液稀释至0.5滋g/ml，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加100滋l，4℃过夜（18～24h）。（2）封闭：次日，弃去孔内溶液并用洗涤缓冲液（PBS）洗板3次，每孔加入200滋l封闭液[含2%牛血清白蛋白（BSA）的洗涤缓冲液]，37℃下封闭2h。（3）加样：弃去孔内溶液并用洗涤缓冲液（PBS）洗板3次，加1：200稀释的血清100滋l至上述已包被好的反应孔内，室温孵育60min。注意设空白孔、阴性对照孔及阳性对照孔，所有样本均设复孔。（4）加酶标抗体：弃去孔内液体并用洗涤缓冲液 [PBST（PBS+0.05% Tween）]洗板5次，每孔加入1：30000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人二抗 （英国Abcam公司）100滋l，室温孵育0.5 h。（5）显色：弃去孔内液体并用洗涤缓冲液（PBST）洗板5次，各孔加入四甲基联苯胺底物反应液100滋l，室温孵育5~10min后加入100滋l反应终止液（1mmol/L硫酸）终止反应，并在450nm处测吸光度A值。

1.3 免疫印迹法检测血清中抗PUF60抗体

随机择取ELISA初筛抗体阳性的SLE患者进行免疫印迹实验验证。（1）制样：用PBS将商品化PUF60蛋白5倍稀释，加入蛋白上样缓冲液后沸水浴5min。（2）制胶：配制10%分离胶及5%浓缩胶，依次注入玻璃板间隙，选合适孔梳，制备上样孔。（3）上样：将protein ladder（美国Thermo公司）及处理过的蛋白上样后开始电泳，平均每孔蛋白量为1滋g。（4）转膜：采用半干转转膜仪，将目的蛋白转移至硝酸纤维素膜（NC膜）上。（5）封闭：转膜后，将NC膜放入5%脱脂奶粉封闭液中，室温封闭2h。（6）孵育一抗：用5%脱脂奶粉按1：100比例稀释患者血清，4℃过夜。（7）孵育二抗：TBST洗膜3次后，用5%脱脂奶粉按1：3000比例稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗人二抗 （Abcam公司），室温反应1h。（8）显色：用1：1混合的ECL化学发光底物A液和B液（美国Pierce公司）将NC膜浸润，放入凝胶成像仪进行显色。

1.4 统计学方法

统计学处理采用SPSS16.0统计软件。描述性资料中符合正态分布者用来表达，非正态分布者则用中位数及四分位数来描述。计量资料组间比较根据数据分布类型分别采用独立样本t检验、方差分析、非参数Mann-Whitney U检验；计数资料采用字2检验或Fisher精确检验。

2 结果

2.1 SLE中抗PUF60抗体的阳性率

入选SLE患者共104例，患者血清抗PUF60抗体的OD值[0.13（0.08，0.22）]显著高于健康对照组[0.101（0.075，0.134）；P=0.002]，见图1。由健康对照组的血清抗体OD值加3倍标准差计算得出抗体阳性的临界值（cut-off value）为0.249，SLE患者中有18例血清抗PUF60抗体高于该临界值，阳性率为17.3%。为进一步验证ELISA结果的可靠性，随机择取4例ELISA结果为阳性的SLE患者及HCs进行免疫印迹实验验证，发现两者之间具有一定的一致性，如图2。

2.2 SLE中抗PUF60抗体的相关临床表现

SLE的常见临床表现包括发热 27例（26.0%）、光过敏44例（42.3%）、雷诺现象17例（16.3%）、皮疹 60例 （57.7%）、脱发 48例（46.2%）、关节炎关节痛36例（34.6%）、狼疮性肾炎62例（59.6%）、狼疮性脑病6例（5.8%）等。进一步对比分析SLE患者中抗PUF60抗体阳性与阴性患者的临床表现，发现抗体阳性者发病年龄偏低（P＜0.01），临床表现多伴脱发（P＜0.05），实验室检查多见补体C4下降 （P＜0.05）及外周血B1细胞数目升高（P＜0.05），见表1。

2.3 SLE中抗PUF60抗体与其他抗体的相关性

抗PUF60抗体阳性的SLE患者中抗dsDNA、Sm、SSB（anti-Sjgren syndrome B antibody）抗体阳性率显著高于阴性组，2组间差异具有统计学意义（P＜0.05），见表2。然而，SLE患者中抗PUF60抗体阳性[93（27，142）]与阴性组[35（0，125）]中的抗dsDNA抗体滴度并无统计学差异 （P＞0.05）。

3 讨论

本研究证实中国SLE患者中存在抗PUF60抗体，阳性率为17.3%。该抗体多见于年轻人群，与脱发的发生、B1细胞数目的升高和补体C4的下降相关。同时，该抗体多与抗dsDNA、Sm、SSB抗体共表达。以上结果提示抗PUF60抗体是一种新型剪接体抗体，与SLE特定的临床表现及实验室指标相关。

表1 抗PUF60抗体阳性与阴性SLE患者临床资料比较

表2 抗PUF60抗体阳性与阴性SLE患者其他自身抗体阳性率比较 n（%）

图1 SLE患者及正常对照组血清抗PUF60抗体滴度

图2 PUF60蛋白免疫印迹实验

剪接体（spliceosome）是存在于真核细胞中的核糖核蛋白复合物，由snRNP及识别剪接信号的蛋白质剪接因子共同构成，参与前体mRNA加工，对mRNA及非编码RNA的生成至关重要[4]。剪接体主要由5种snRNPs构成，包括U1snRNP、U2snRNP、U4snRNP、U5snRNP、U6snRNP[2]。所有的snRNP均含有一套相同的蛋白质，即7个Sm蛋白，该蛋白由7种核心蛋白构成，包括SmB、SmD1、SmD2、SmD3、SmE、SmF、SmG[5]。Sm蛋白能被10%~30%的SLE患者体内抗体所识别，是其特异性的靶抗原。此外，约30%~40%SLE患者体内可检测到抗U1RNP抗体，靶抗原为U1snRNP的特异性蛋白（U1-A、U1-C、U1-70k）[6]。

PUF60蛋白是U2snRNP复合物中的一员，结构与U2AF65剪接因子 （U2-associated factor，65 kDa）同源，两者协同作用于U2snRNP，加强其与pre-mRNA的结合[7，8]。近来文献[2]报道29.8%干燥综合征患者可检出该抗体，并与抗-Ro52抗体、类风湿因子及高球蛋白血症相关，此外还见于18%的高加索皮肌炎患者，并与抗TIFγ抗体相关。

结合本文的研究结果，以下4个方面均可证明抗PUF60抗体在SLE中的研究价值。（1）补体在SLE的发病中具有双重作用，补体C3、C4的降低可见于75%的SLE患者，而且在伴发肾损害的患者中比例更大，可达90%[9]。（2）B1细胞（尤其是B1a）数目在SLE患者外周血中往往升高，其可通过刺激CD4+T细胞增殖而诱导自身免疫失调的发生[10]。（3）10%~15%的SLE患者可伴抗SSB/La抗体阳性，该抗体不仅与新生儿狼疮、迟发性SLE及继发性干燥样综合征相关，还可通过干预中性粒细胞的吞噬功能来参与SLE的发病[11]。（4）抗dsDNA抗体及抗Sm抗体分别见于40%~60%及10%~30%的SLE患者中，对于SLE的诊断具有高度的特异性[12]。因此，虽然本研究并未发现抗PUF60抗体与SLE中典型皮疹、关节痛、肾脏及神经系统的损害等代表性的临床表现相关，但是其与补体、淋巴细胞亚群及某些抗体的相关性均证明了其潜在的研究价值。尤其是抗PUF60抗体与抗dsDNA抗体的共表达现象，其在SLE肾损害及疾病活动度方面的预测价值有待进一步探讨。

综上所述，本研究首次探讨了我国SLE患者血清抗PUF60抗体的分布及其临床意义，发现抗PUF60抗体是SLE的相关性抗体，抗体阳性者发病年龄小，易伴发脱发，同时会发生特定的实验室指标异常。开展抗PUF60抗体的检测，不仅对SLE的临床研究具有一定意义，还有助于发现SLE的潜在致病机制。

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The prevalence of anti-PUF60 autoantibodies in patients with systemic lupus erythematosus/

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ZHANG Ya-mei，PENG Qing-lin，LU Xin，et al//Journal of China-Japan Friendship Hospital，2017 Feb，31（1）：3-6

Objective：To determine the sera levels and clinical significance of anti-PUF60（poly-U-binding factor 60 kDa）antibodies in patients with systemic lupus erythematosus（SLE）.Methods：Sera from 104 Chinese patients with SLE and 163 healthy controls were collected.The anti-PUF60 antibodies were measured by enzyme linked immunosorbent assay.Four cases positive sera were further examined by immunoblot assays.Results：The positive rate of sera anti-PUF60 autoantibodies in patients with SLE was 17.3%（18/104）.The anti-PUF60-positive patients had significantly younger age[21（18，27）vs 29（20，37）years old，P=0.007]and higher incidence of alopecia[72.2%（13/18）vs 40.7%（35/86），P＜0.05]than the anti-PUF60-negative patients.Compared with anti-PUF60-negative patients，the occurrences of hypocomplementemia，elevated B1-cell subpopulations were much higher in anti-PUF60-positive patients than in anti-PUF60-negative patients（P＜0.05）.Meanwhile，the positive rates of anti-dsDNA，Sm，SSB were higher in patients with positive anti-PUF60 antibodies（P＜0.05）.Conclusion：We found that anti-PUF60 antibody was a new valuable SLE-associated antibody in Chinese，which related to specific clinical manifestations.

systemic lupus erythematosus；autoantibodies；anti-PUF60 autoantibodies

R593.24

A

1001-0025（2017）01-0003-04

10.3969/j.issn.1001-0025.2017.01.001

国家自然科学基金（91542121，81571603），中日友好医院院级课题青年项目（2014-3-QN-25）。

3* 本文通讯作者。

张亚妹（1992-），女，硕士研究生。

2016-12-08

2016-12-26