不同培养时间对鸡卵泡颗粒细胞孕酮、雌激素分泌水平及FSHR、LHR基因表达的影响*

李 悦， 计 红Δ， 薛琳琳， 马 莉， 杨焕民， 连 帅， 郭文晋，张宇辰， 翟俊飞， 郭景茹， 刘艳芝， 甄 莉

(1. 黑龙江八一农垦大学动物科技学院， 大庆 163319； 2. 黑龙江职业学院， 双城 150025)

不同培养时间对鸡卵泡颗粒细胞孕酮、雌激素分泌水平及FSHR、LHR基因表达的影响*

李 悦1， 计 红1Δ， 薛琳琳2， 马 莉1， 杨焕民1， 连 帅1， 郭文晋1，张宇辰1， 翟俊飞1， 郭景茹1， 刘艳芝1， 甄 莉1

(1. 黑龙江八一农垦大学动物科技学院， 大庆 163319； 2. 黑龙江职业学院， 双城 150025)

目的：研究培养不同时间鸡卵泡颗粒细胞孕酮和雌激素的分泌水平，促卵泡素受体(FSHR)和促黄体素受体(LHR)的基因表达水平，推断体外培养时间对颗粒细胞激素分泌及相关受体基因表达的影响。方法：通过细胞体外培养的方法，分别于0 h、24 h、48 h、72 h、96 h收集鸡卵泡颗粒细胞上清液，采用ELISA法测定细胞上清液内的孕酮及雌激素分泌水平，并采用荧光定量PCR技术检测颗粒细胞内FSHR和LHR基因表达情况。结果：在培养初期0 h～48 h孕酮和雌激素分泌量显著降低(P<0.05)，随着培养时间增加到72 h两种激素的分泌量又开始增加，并达到培养初期水平，培养至96 h细胞内孕酮和雌激素分泌量再次降低；颗粒细胞FSHR和LHR mRNA的表达水平则随着培养时间的增加而降低(P<0.05)。结论：体外培养的卵泡颗粒细胞内孕酮和雌激素的分泌量随体外培养时间的延长呈先降低后升高的趋势，可能与体外培养细胞的生长状态相关，从整体上看随着培养时间的延长，细胞内孕酮和雌激素的分泌量均降低，可能与两种促性腺激素受体FSHR和LHR基因表达量下降相关。

蛋鸡；卵泡颗粒细胞；孕酮；雌激素；促卵泡素受体；促黄体素受体

【DOI】 10.12047/j.cjap.5458.2017.044

家禽的产蛋性能主要取决于卵巢中卵泡的生长和发育水平，卵泡是生长最快的组织之一，处于产蛋期的家禽的卵巢中存在陆续成熟、大小不等的卵泡，而卵母细胞、颗粒细胞与内膜细胞的分化则是卵泡生长的主要原因[1]。禽类产蛋性能主要由发育至等级发育阶段的卵泡数决定，而体内激素的分泌决定着卵泡发育的等级与阶段[2]。卵泡颗粒细胞层和内膜细胞层是禽体内雌激素、孕酮等重要的分泌组织。颗粒细胞作为卵泡的体细胞，通过细胞间的相互作用，对卵泡膜细胞和卵母细胞的发育、成熟及功能起重要的调控作用，进而影响卵泡的启动、发育、成熟及闭锁的全过程[3]。

研究表明，禽类卵泡的发育主要受垂体促卵泡素(follicle stimulating hormone，FSH) 和促黄体素(luteinizing hormone，LH) 的控制，前者促进小卵泡进入等级发育阶段，后者促进类固醇激素合成和分泌[4]。FSH与LH要发挥作用必须依赖于相应受体FSHR和LHR的表达，所以FSHR、LHR的表达调控对于FSH和LH实现自身功能是非常重要的。本实验主要研究培养不同时间鸡卵泡颗粒细胞孕酮和雌激素的分泌能力及两种促性腺激素受体基因表达水平，为提高禽类的产蛋机能提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

产蛋期(8月龄)蛋鸡20只，本实验室饲养提供，饲养条件：21℃～23℃适宜温度，自由摄食。科学饲养同时记录每天产蛋情况。

1.2 实验方法

1.2.1 鸡颗粒细胞剥离培养 选用正在产蛋的蛋鸡，取等级卵泡，通过参考Gillbert等[5]的方法并结合本实验加以改进，剥离颗粒细胞层。将剥离出的颗粒细胞膜在浓度为0.75%的盐水中清洗3～4次，去除膜内所包含的卵黄物质，清洗后放入装有10 ml生理盐水的培养皿中。再用小剪刀将颗粒细胞膜剪成约1～3 mm3的小块，加入2.5 μg/ml Ⅳ型胶原酶置于37℃的恒温培养箱内消化3 min。200目滤网过滤细胞膜混合液，制备得到粗制的颗粒细胞悬液。将滤液以1 000 r/min的转速离心8 min弃上清。用含有血清的M199培养液清洗细胞2次以去除残存的胶原酶，以及细胞碎片。沉淀的颗粒细胞中加入含10.0%胎牛血清的M199培养液1 ml充分混匀，制备成颗粒细胞悬液。取5 μl混匀的细胞悬液加入0.1%台盼蓝5 μl，用血球计数板计数，并计算出1 ml细胞培养液中的细胞量，12孔细胞培养板每孔8×105细胞接种，随后将细胞板放入CO2细胞培养箱内，在37℃，5% CO2条件下进行培养。

1.2.2 颗粒细胞样品收集与冻存 颗粒细胞在CO2培养箱内培养至24 h时，将细胞培养板取出，在镜下观察细胞生长状态，选取生长状态优良的细胞，弃去培养液，加入PBS液洗涤细胞，重复洗涤两次，弃掉PBS液。再向每孔中加入0.3 ml胰蛋白酶，置于37℃培养箱中消化2 min，镜下观察分成为单个细胞即可加入一定量的M199培养液以终止消化。反复吹打孔内细胞液，将其吹打为颗粒细胞悬液后转移到15 ml离心管中离心(1 000 r/min，4 min)，弃上清，加入细胞培养液，密封，-80℃冻存待测。按照如上方法在分别收集培养0 h、48 h、72 h、96 h的细胞上清液，并在 -80℃冻存待测。

1.2.3 ELISA法测定细胞培养液中孕酮和雌激素浓度 按照ELISA检测试剂盒使用说明书中具体步骤操作，使用酶标仪检测450 nm波长处各孔的OD值。在Excel工作表中，以标准曲线为横坐标，对应OD值为纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按照曲线方程计算出培养不同时间细胞上清液内孕酮、雌激素浓度值。

1.2.4 颗粒细胞培养液中总RNA的提取 从-80℃冰箱中取出冻存的细胞液，室温解冻后置于低温离心机中1 000 r/min离心10 min，去上清。每3孔细胞中加入1 ml Trizol，充分混匀，室温静置5 min后，10 000 r/min离心5 min。取上清液，加入200 μl氯仿，用力振摇15 s，室温静置2～3 min，置于低温离心机中进行12 000 r/min离心15 min。离心后，管中液体分为三层，小心吸取上层无色水样液体，于另一个离心管中，再加入500 μl异丙醇，室温下静置10 min后，12 000 r/min，离心10 min。弃去上清，可见管底白色小块沉淀，加入75% 乙醇1 ml，振荡30 s后，7 500 r/min，离心5 min。弃上清，干燥沉淀约3～5 min。

1.2.5 总RNA质量的检测 检测总RNA完整性：应用1% 琼脂糖凝胶电泳试验，取1 μl总RNA，检测5S、18S和28S三条带是否完整，从而确定提取的总RNA 是否能用于下一步试验。检测总RNA浓度：将提取出的总RNA 1 μl溶解于20 μl DEPC处理水中，反复混匀后，取1 μl混合液应用核酸定量分析仪测定出总RNA的OD值，测定的OD260/280比值应在1.8～2.0之间。

1.2.6 PCR引物设计与合成 根据GeneBank中原鸡FSHR和绿头鸭LHR和GAPDH的基因序列，在保守区利用Primer 5.0引物设计软件，设计扩增FSHR、LHR以及GAPDH基因的引物。内参基因GAPDH的上游引物为5′-GCTGATGCTCCCATGTTCGTGAT-3′，下游引物为5′-GTGGTGCAAGAGGCATTGCTGAC-3′，扩增片段长度为86 bp。 FSHR的上游引物为5′-TCCTGTGCTAACCCTTTCCTCTA-3′，下游引物为5′-AACCAGTGAATAAATAGTCCATC-3′，扩增片段长度为207 bp。LHR的上游引物为5′-GTAACACTGGAATAAGGGAAT-3′，下游引物为5′-GAAGGCTTGACTGTGGATA-3′，扩增片段长度为191 bp。引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.7 RT-PCR反应 将提取的各时间点的细胞中总RNA按反转录试剂盒中的反应体系反转为cDNA，并进行PCR反应。扩增条件分别为：FSHR为95℃ 5 min预变性，95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，30个循环，72℃ 10 min；LHR为95℃ 5 min预变性，95℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 20 s，30个循环，72℃ 10 min。50 μl PCR反应体系为：10×PCR Buffer 5 μl，cDNA模板1 μl，dNTP (2.5 mmol/L)8 μl，Taq酶(5 U/μl,)0.5 μl，上下游引物(20 pmol/μl)各1 μl，加水至总体积50 μl。GAPDH在以上两个PCR反应条件下均能反应。

1.3 统计学处理

实验数据利用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，结果采用多重比较中的字母标记法表示。

2 结果

2.1 卵泡颗粒细胞形态学观察

颗粒细胞经台盼蓝染色在倒置显微镜下观察到培养初始的卵泡颗粒细胞形状呈圆形，细胞中心可见黑色的点状物；培养至24 h时，细胞逐渐开始贴壁、增殖，贴壁良好，生长旺盛，细胞与细胞之间有延长的丝状突起相互连接，呈多角形。培养至48 h时镜下观察可见细胞呈单层贴壁生长，贴壁细胞形态完整，边缘清晰。卵泡颗粒细胞在培养第96 h后，细胞开始逐渐走向退化，产生发亮空泡状细胞即为死亡的颗粒细胞(图1)。

2.2 不同培养时间卵泡颗粒细胞孕酮、雌激素的分泌水平

由0 h培养至48 h，细胞上清液内孕激素的浓度降低；培养至72 h时，分泌量升高，与培养24 h、48 h的细胞上清液内孕酮浓度相比均差异显著(P<0.05)；继续培养至96 h 细胞上清液内孕酮的浓度再次降低，与培养0 h、72 h的细胞上清液内孕酮浓度相比均差异显著(P<0.05)。而细胞内雌激素分泌量则在培养24 h时降低，且与0 h相比差异显著(P<0.05)；培养至48 h后，雌激素分泌量开始逐渐升高，且培养72 h、96 h与培养24 h的细胞内孕酮分泌量相比均差异显著(P<0.05)。

Fig. 1 The follicular granulosa cell morphological observation in different culture time(×100) A: 0 h B: 24 h C: 48 h D: 96 h

Tab. 1 The progesterone and estrogen concentration of Granulosa cell supernatant in different culture time

Culturetime(h)Progesterone(ng/ml)Estrogen(pg/ml)00.31±0.0665.70±4.66240.21±0.05*45.65±7.67*480.17±0.02*53.86±4.12720.34±0.01#△62.32±4.53#960.22±0.07*▲57.73±3.72#

*P<0.05vs0 h;?#P<0.05vs24 h，△P<0.05vs48 h；?▲P<0.05vs72 h

2.3 细胞中总RNA的变化

提取培养不同时间卵泡颗粒细胞内的总RNA(图2)，经1% 琼脂糖凝胶电泳检测结果显示：总RNA条带完整，其中28S rRNA条带最亮，18S rRNA条带较亮，5S rRNA最暗，说明RNA提取完整，符合继续实验的要求。总RNA经核酸蛋白测定仪测定的OD260/280值在1.80～2.00之间，符合实验要求。

2.4 RT-PCR扩增目的片段结果

将反转录获得的cDNA作为模板扩增目的片段后，通过1%琼脂糖凝胶电泳验证目的基因。将凝胶置于紫外灯下观察，观察到PCR扩增的产物条带清晰，目的条带(86 bp、207 bp和191 bp)与预期大小相符，证明引物序列设计特异性较高，满足后续荧光定量PCR要求(图3)。

2.5 荧光定量检测FSHR mRNA表达情况

应用荧光定量仪检测不同培养时间FSHR mRNA的表达情况。结果显示：在0 h时，FSHR mRNA表达量较高，且显著高于其他各组；随着培养时间增加mRNA表达量逐渐降低。其中与培养48 h、72 h、96 h相比，培养24 h FSHR mRNA的表达量均差异显著(P<0.05，图4)。

Fig. 2 Total RNA of uterin、ovarian and infundibulum

Fig. 3 GAPDH, FSHR, LHR gene PCR products M: DNA Maker DL2 000; 1: GAPDH(86 bp); 2: FSHR(207 bp); 3: LHR(191 bp)

Fig. 4 The FSHR mRNA expression of granulosa cells in different culture time*P<0.05vs0 h;?#P<0.05vs24 h

2.6 荧光定量检测LHR mRNA表达情况

应用荧光定量仪检测不同培养时间LHR mRNA的表达情况。结果显示：在刚培养时LHR mRNA表达量较高，且显著高于其他各组。随着培养时间增加LHR mRNA表达量降低，但在培养48 h时LHR mRNA 的表达量升高且与培养24 h、72 h、96 h LHR mRNA的表达量相比均差异显著(P<0.05，图5)。

3 讨论

雌禽卵泡发育除受FSH和LH调控外，还受到雌激素、孕酮等的其他激素的影响。雌激素由卵泡内膜细胞分泌，它既可以促进卵泡的发育成熟，抑制

Fig. 5 LHR mRNA expression of Granulosa cells in different culture time*P<0.05vs0 h;?#P<0.05vs24 h;?△P<0.05vs48 h

卵泡闭锁，又可以使促性腺激素受体增多；而卵泡颗粒细胞分泌的孕酮在卵泡将要成熟时，含量不断增多，同时又会促使LH分泌量达到高峰[6]。

颗粒细胞是内胚层起源的上皮细胞，也是一种典型的类固醇激素内分泌细胞。它的主要功能是分泌孕酮，并把孕酮运输给细胞膜，然后再合成雌激素和雄激素[7]。孕酮是许多类固醇激素(雌激素、雄激素和肾上腺皮质激素)生物合成的重要前驱体。在排卵前，卵泡液中含有一定浓度的孕酮。有研究者推测，卵泡成熟的信号转导可能需要特殊的卵泡内孕酮浓度[8]。在体外培养过程中颗粒细胞内孕酮分泌量降低时雌激素分泌量也降低，而当孕酮分泌量升高时雌激素分泌量也有所升高。这表明在体外培养卵泡颗粒细胞内孕酮对雌激素的分泌也具有重要的调控作用。雌激素主要是在膜层分泌，而颗粒细胞内也可以分泌少量雌激素。Richards等认为雌激素可以通过促进LHR表达从而促进颗粒细胞发育[9]。当卵泡颗粒细胞体外培养至24 h～48 h时，颗粒细胞间缝隙连接的数量增多，细胞内雌激素分泌量显著升高，且LHR mRNA的表达量升高，说明此时颗粒细胞发育速度较快，且体外培养的颗粒细胞内雌激素分泌能力可通过调控LHR表达量进而影响颗粒细胞的生长、增殖及功能。

FSHR 基因的表达依赖于不同激素的刺激。研究显示，FSH对FSHR基因的表达起主要调控作用，而雌激素可以协同FSH促进颗粒细胞FSHR的表达，但是单独进行雌激素处理时，并不能增加颗粒细胞中FSHR的表达[10]。颗粒细胞体外培养24 h～72 h时，细胞内分泌的雌激素含量逐渐升高，但FSHR mRNA的表达量并未随之升高，且在培养48 h时FSHR mRNA的表达量明显降低。由此可见，颗粒细胞内分泌的雌激素虽然与细胞内FSHR mRNA的表达具有相关性，但并非直接调控作用。LH是垂体分泌的一种糖蛋白激素，是诱发排卵的主要因素之一。LH 的生理功能是通过分布于性腺细胞膜上的特异性受体(LHR)所介导的。研究发现，LHR 是由雌激素与FSH协同诱导形成的[11]，LHR分化反过来又会增强卵泡内雌激素合成的能力。在卵泡颗粒细胞体外培养时，当雌激素分泌量降低，细胞内LHR mRNA表达量也会降低；当LHR mRNA表达量较高时，雌激素的分泌量也会升高。因此推测，体外培养的卵泡颗粒细胞内雌激素与LHR之间也具有相互作用。

本实验研究发现随着培养时间的延长，体外培养的卵泡颗粒细胞内孕酮和雌激素的分泌水平降低，这可能与细胞内两种促性腺激素受体FSHR和LHR基因表达量下降相关，并受到体外培养细胞的生长状态的影响。通过对体外培养不同时间内卵泡颗粒细胞内孕酮和雌激素分泌水平及相关激素受体基因表达量的检测，为其他关于卵泡颗粒细胞分泌、功能的研究提供了理论基础和试验依据。

[1] 张伟宏, 计 红, 王江璐, 等. 籽鹅卵泡颗粒细胞烯醇化酶过表达模型的建立及其对孕酮分泌的影响[J]. 中国应用生理学杂志, 2014, 30(1): 85-88.

[2] 梁国朋, 于长良, 孙永峰. 鹅卵泡膜层与颗粒层内激素调控规律的研究[J]. 黑龙江畜牧兽医, 2010, 265(4): 15-17.

[3] 金艳梅. 颗粒细胞对卵泡发育的影响[J]. 中国畜牧兽医, 2010, 32(8): 69-72.

[4] Proszkowiec M, Rzasa J. Variation in the o-varian and plasma progesterone and estradiol level of the domes-tic hen during a pause in laying [J].FoliaBiologica(Krakw), 2001, 49(3-4): 285-289.

[5] Gilbert AB, Evans AJ, Perry MM,etal. A method for separating the granulosa cells, the basal lamina and the theca of the preovulatory ovarian follicle of the domestic fowl (Gallus domesticus)[J].JReprodFert, 1977, 50(1): 179-181.

[6] 卢建军. 影响蛋禽产蛋率的主要生理因素[J]. 中国家禽, 2006, 28(1): 42-44.

[7] Schmierer B, Schuster MK, Shkumatava A,etal. Activin and Follicle-Stimulating Hormone Signaling Are Required for Long-Term Culture of Functionally Differentiated Primary Granulosa Cells from the Chicken Ovary[J].BiolReprod, 2003, 68(2): 620-627.

[8] Isaza V, Garcia-Velasco JA, AragonesM,etal. Oocyte and embryo quality after coasting: the experience from oocyte donation[J].HumReprod, 2002, 17(7): 1777-1782.

[9] Richards JS, Jonassen JA, Rolfes AI,etal. Adenosine 30, 50-monophosphate, luteinizing hormone receptor, and progesterone during granulosa cell differentiation: effects of estradiol and folliclestimulating hormone[J].Endocrinol, 1979, 104: 765-773.

[10]相德才, 王春光, 叶绍辉. 鸡FSHR基因研究进展[J]. 畜牧兽医科技信息, 2014, (6): 4-5.

[11]Kessel B, Liu Y X, Jia X C,etal. Autocrine role of estrogens in the augmentation of luteinizing hormone receptor formation on cultured rat granulose cells[J].BiolReprod, 1985, 32(5): 1038-1050.

The research of the progesterone and estrogen secretion level and the FSHR, LHR gene quantitative in granular cells culturedinvitroin different time of laying hens

LI Yue1， JI Hong1Δ， XUE Lin-lin2， MA Li1， YANG Huan-min1， LIAN Shuai1， GUO Wen-jin1，ZHANG YU-chen1， ZHAI Jun-fei1， GUO Jing-ru1， LIU Yan-zhi1， ZHEN Li1

(1. College of Animal Science and Technology, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319；2. Heilongjiang Polytechnic， Shuangcheng 150111， China)

Objective: To research the hormone secretion levels of progesterone and estrogen and the gene expression levels of two gonadotropin receptors follicle stimulating hormone receptor (FSHR) and luteinizing hormone receptor (LHR) in granular cells of laying hen, and the effect of culture time on the levels of hormone secretion and expression of related receptor gene in granulosa cells was inferred. Methods: The experiment using the method of cells culture in vitro, the granular cells supernatants of hens were collected at 0 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, the progesterone and estrogen concentrations in cell supernatants were determined by ELISA kits, and detected the expression of FSHR and LHR gene in granular cells by real-time fluorescent quantitative PCR. Results: The results showed that the progesterone and estrogen secretion reduced in the early culture of 0 h～48 h(P<0.05), with the culture time increases to 72 h, the secretion of two hormones began to increase, and reaching the level of the initial level of culture. When the cells were cultured to 96 h, the rogesterone and estrogen secretion was reduced again. The lower levels of FSHR and LHR mRNA expression in granular cells appeared with the increase of culture time, compared with the group of cell culture to 0 h, the mRNA expression levels of each groups reduced obviously(P<0.05). Conclusion: The amount of progesterone and estrogen in the cultured follicular granulosa cells decreased with the increase of in vitro culture time, and then increased. This might be related to the growth state of cells cultured in vitro. But on the whole, with the extension of the training time, the secretion of progesterone and estrogen in the cells decreased. This may be related to the decreased expression of the FSHR and LHR genes in the two gonadotropin receptors.

laying hens； granular cells； progesterone； estrogen； follicle-stimulating hormone receptor； luteinizing hormone receptor

国家自然科学基金项目(31302052)；黑龙江省自然科学基金项目(ZD201116)

2016-05-26

2016-11-28

S835

A

1000-6834(2017)02-174-05

△【通讯作者】Tel： 13936967552； E-mail： jihonghljbynd@aliyu.com