MiR-218对滋养层细胞迁移侵袭的影响及其机制研究*

陈育娟， 吴培阳， 高瑞秋

(1. 厦门市妇幼保健院产科， 福建 厦门 361000; 2. 厦门大学附属第一医院医务科， 福建 厦门 361000)

MiR-218对滋养层细胞迁移侵袭的影响及其机制研究*

陈育娟1△， 吴培阳2， 高瑞秋1

(1. 厦门市妇幼保健院产科， 福建 厦门 361000; 2. 厦门大学附属第一医院医务科， 福建 厦门 361000)

目的：研究miR-218是否通过下调SOX4影响滋养层细胞系HTR-8细胞的迁移和侵袭。方法：妊娠期高血压疾病(HDCP)患者46例，平均年龄(31±4.6)岁，收缩期血压≥140 mmHg和/或舒张期血压>90 mmHg；以血压正常孕妇50例为对照，实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测两组患者静脉血中miR-218的表达情况。转染miR-218mimic和miR-NC至离体培养的HTR-8细胞中，将细胞分为对照组(加入DMEM)、空质粒组(加入miR-NC)和过表达miR-218组(加入miR-218 mimic)3组，检测细胞的迁移侵袭情况以及细胞中MMP-2和MMP-9的表达，，生物信息学预测miR-218潜在靶基因为SOX4，利用荧光素酶素试验验证SOX4是miR-218的靶基因；再通过转染过表达SOX4的质粒至HTR-8细胞，HTR-8细胞分为过表达miR-218组、过表达miR-218+空质粒组、过表达miR-218+SOX4组，以上方法检测HTR-8细胞的迁移侵袭情况。结果：相比于正常孕妇组，HDCP组患者血清中miR-218表达减少(P<0.01)。相比于空质粒组，转染miR-218mimic后，HTR-8细胞中MMP-2、MMP-9、SOX4的表达减少(P<0.01)，细胞迁移和侵袭能力下降(P<0.01)；荧光素酶试验结果显示，miR-218能够显著降低 SOX4-3'-UTR 质粒的荧光素活性(P<0.01)；相比于miR-218+空质粒组，转染过表达SOX4质粒后，HTR-8细胞迁移和侵袭能力增加(P<0.01)。结论：HDCP患者血清中miR-218表达减少，miR-218可以通过下调SOX4从而抑制HTR-8细胞的迁移和侵袭。

妊娠期高血压疾病；微小RNA218；SOX4；滋养层细胞；侵袭

【DOI】 10.12047/j.cjap.5453.2017.043

功能性胎盘的形成是胚胎正常发育的基础，

在胎盘发育过程中，滋养层细胞的迁移与侵袭受到机体严格的调节。目前研究表明滋养层细胞的过度迁移和侵袭在早期流产、妊娠期高血压疾病(hypertensive disorder complicating pregnancy，HDCP)以及胎儿宫内发育迟缓等妊娠期疾病的发生发展中具有重要的作用[1]。

MiRNAs是一类内源性的非编码RNA，由19～25个左右核苷酸组成，通过与靶mRNA的3’-UTR碱基互补配对，从而抑制mRNA翻译或直接使其降解，导致靶基因的表达在转录后水平受到抑制，最终调控基因表达。现已有多个研究发现miRNAs参与HDCP的进程[4,5]。MiR-218是一种miRNA，我们前期研究发现miR-218在HDCP患者血清中表达降低，推测miR-218的表达失衡可能参与HDCP的病理生理过程。生物信息检索发现性别决定区域转录因子4(sex determining region Y-box 4，SOX4)基因为miR-218的潜在作用位点，而SOX4在调控细胞的迁移和侵袭功能中具有重要的作用[6]。本研究拟通过用miR-218干预滋养层细胞系HTR-8细胞，探索miR-218对HTR-8细胞迁移侵袭能力的影响，并拟进一步用荧光酶素试验和转染过表达SOX4质粒至HTR-8细胞的方法验证miR-218是通过靶向抑制SOX4的表达从而发挥抑制HTR-8细胞迁移侵袭的作用，探讨miR-218在HDCP发病机制中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集厦门市妇幼保健院HDCP患者46例，平均年龄(31±4.6)岁，行孕检的无高血压孕妇50例，平均年龄(29±4.1)岁。采集患者静脉血后立即离心，上清液-80℃冰箱保存。HDCP患者血压：收缩期血压≥140 mmHg和/或舒张期血压>90 mmHg；正常孕妇血压：收缩期血压<140 mmHg和/或舒张期血压<90 mmHg。本研究中患者均签署知情同意书，并由医学伦理委员会审核通过。

1.2 实验试剂

滋养层细胞系HTR-8细胞购于上海拜力生物公司；限制性内切酶BamHⅠ、T4 DNA连接酶、XhoⅠ、RNA提取试剂(Invitrogen公司)；DMEM培养液、胰蛋白酶(Sigma公司)；胎牛血清(GIBCO公司)；takara逆转录试剂盒(大连宝生物公司)；SYBR Green荧光染料试剂盒(Roche公司)；无内毒素质粒小、大提取试剂盒；兔或鼠抗人MMP-2、MMP-9、SOX4、GAPDH、β-actin多克隆抗体(ABCAM公司)；脂质体2000(上海英骏公司)；DAPI(Rcohe公司)；辣根过氧化酶标记的山羊抗兔或者抗鼠二抗、FITC标记的山羊抗兔IGg(jackson公司)；Western blot相关试剂(江苏碧云天生物技术研究所)。

1.3 实验分组

在miR-218mimic转染HTR-8细胞后，将细胞分为对照组、空质粒组和过表达miR-218组3组；在用过表达SOX4的质粒转染HTR-8细胞后，将HTR-8细胞分为过表达miR-218组、过表达miR-218+空质粒组、过表达miR-218+SOX4组。

1.4 转染细胞株

过表达质粒的构建：miR-218-mimic由上海吉玛公司设计合成，miR-218-mimic序列为，正义链：5'- ACAUGGUUAGAUCAAGCACAA-3'，反义链：3'- UGUACCAAUCUAGUUCGUGUU-5'[7]。SOX4过表达质粒由上海吉玛公司设计合成，通过Pubmed查找SOX4基因的序列，引物根据Genebank中SOX4 mRNA序列设计引物。其上游引物： 5′-CTTGACATGATTAGCTGGCATGATT -3′；下游引物：5′-CCTGTGCAATATGCCGTGTAGA -3′。Sox4基因和质粒DNA连接后，筛选重组质粒，测序验证。

转染：将HTR-8细胞接种至6孔板，待细胞生长至50%～70%密度时，以脂质体2000分别转染miR-218mimic或mimic-对照；SOX4过表达质粒或空质粒，各100 pmol 24 h后，提取总RNA或者蛋白后，通过PCR或者Western blot鉴定转染的效率，进行后续试验。

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1.5 荧光定量RT-PCR检测基因表达

提取血清或细胞中的总RNA，将提取的总RNA逆转录成 cDNA，反应体系为20 μl，反应条件为：16℃(30 min)，45℃(30 min)，85℃(5 min)。miR-128的引物为forward: 5′-CGGGCTTGTGCTTGATCTA-3′; reverse:5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′. U6的引物为forward: 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′; reverse: 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′.运用SYBR Green法检测miR-218的表达情况，运用的反应条件为：94℃(15 min)，94℃(30 s)，60℃(30 s)，72℃(30 s)，共循环40次；最后72℃延伸8 min。每组样品重复3次，试验重复3次，统计分析各标本中miR-218的表达。

1.6 Western blot检测蛋白表达量

提取细胞总蛋白，BCA法定量蛋白后，SDS-PAGE胶每孔加入20 μl的样品，80 V 30 min进行蛋白浓缩，110 V 2 h进行蛋白分离，并用孔径0.45 μm的PVDF膜250 mA 80 min进行蛋白转膜。转膜后常温下TBST漂洗3次、封闭血清封闭1 h后，以1∶1 000浓度加入兔(鼠)抗人MMP-2一抗(或抗MMP-9、SOX4、β-actin一抗)，4℃孵育过夜，常温下TBST洗膜3次，辣根过氧化物酶标记羊抗兔(鼠)二抗孵育后ECL化学发光法检测。柯达胶片暗室显影，Quantity one软件分析。

1.7 划痕实验(Wound healing)

HTR-8细胞铺满板底后，无血清培养基培养24 h使细胞同步化，加入 1.8 mmol /L 羟基脲作用 12 h抑制细胞增殖，根据上述分组转染细胞，转染成功后。用100 μl枪头垂直孔板制造划痕，弃细胞培养液，PBS冲洗孔板3次，继续在细胞培养箱中培养。拍照记录0、24 h图片，用image pro plus6.0分析计算出细胞迁移的面积，细胞迁移的面积与原划痕面积比值表示各组细胞的迁移情况。

1.8 Transwell法测细胞迁移

1.9 荧光素酶试验

设计合成SOX4-3'-UTR的序列及突变序列，以SOX4质粒为载体，分别构建能够表达荧光素酶的包含SOX4-3'-UTR和SOX4-3'-UTR突变序列的质粒，然后将HTR-8细胞按每孔1×105接种至24孔板，24 h后以脂质体2000共转染200 ng 包含SOX4-3'-UTR或SOX4-3'-UTR突变序列的荧光素酶质粒和80 ng 海肾荧光质粒以及60 pmol miR-218 mimic或对照，48 h后用荧光检测仪检测荧光强度，海肾荧光作为内参照，每组试验重复3次。

1.10 统计学处理

2 结果

2.1 miR-218在HDCP患者和正常孕妇血清中的表达情况

实时荧光定量PCR检测HDCP患者和正常孕妇血清中miR-218的表达情况，结果发现HDCP患者血清中 miR-218的表达明显低于正常孕妇(P<0.01，图1)。

2.2 miR-218对HTR-8细胞迁移侵袭的影响

MiR-218 mimic转染HTR-8细胞后，实时荧光定量PCR检测结果发现miR-218组中miR-218的表达较对照组和空质粒组明显升高(P<0.01，图2A)。MiR-218mimic转染HTR-8细胞细胞后，相比于对照组和空质粒组，miR-218组中HTR-8细胞的迁移减少(P<0.01，图2B)；侵袭能力降低(P<0.01，图2C)。Western blot检测发现，相比于空白对照组和空质粒组，miR-218组HTR-8细胞中MMP-2、MMP-9这两种与细胞侵袭迁移密切相关的蛋白表达减少(P<0.01，图2D)。

Fig. 1 Expressions of miR-218 in the serum of normal pregnant woman and HDPC patients HDCP: Hypertensive disorder complicating pregnancyn(Normal control)=50;n(HDCP)=46**P<0.01vsnormal control

2.3 miR-218通过识别3'-UTR抑制SOX4的表达

分别构建包含SOX4-3'-UTR和其突变序列的荧光素酶质粒(图3A)，与miR-218-mimic或者空质粒对照共转HTR-8细胞，培养24 h后，检测各组细胞荧光素酶活性。结果显示，miR-218-mimic+WT-SOX4-3'-UTR组荧光素酶活性显著低于空质粒+WT-SOX4-3'-UTR组(P<0.01,图3B)。Western blot检测结果显示，相比于对照组和空质粒组，miR-218组HTR-8细胞中SOX4的表达明显降低(P<0.01,图3C)。

2.4 过表达SOX4可以逆转miR-218对HTR-8细胞迁移侵袭的抑制作用

过表达Sox4的质粒转染HTR-8细胞后，相比于空质粒组，Sox4组HTR-8细胞中Sox4的表达增加(P<0.01，图4A)；相比于miR-218组和miR-218+空质粒组，miR-218+Sox4组中HTR-8细胞的迁移和侵袭增加(P<0.01，图4B)；Western blot检测发现，相比于miR-218组和miR-218+空质粒组，miR-218+Sox4组HTR-8细胞中MMP-2、MMP-9表达增加(P<0.01，图4C、D)。

3 讨论

蛋白的表达，从而发挥抑制多种肿瘤细胞增殖和侵袭的作用[10,11]。本研究通过用miR-218干预HTR-8细胞，发现miR-218可以抑制HTR-8细胞中MMP-2、MMP-9的表达，可以抑制HTR-8细胞的迁移和侵袭，这可能是miR-218参与HDPC病理生理进程的机制之一。

SOX4基因属于SOX C亚族，主要表达于胚胎发育过程中的中枢神经系统、心脏和胸腺。目前已有多个研究证实SOX4表达增加可以促进细胞的增殖和迁移[6,12]。Wang等人研究结果显示miR-211可以通过靶向抑制Sox4的表达从而抑制胃癌细胞的增殖和迁移[6]。之后Jin等人的研究结果也显示miR-388可以通过下调Sox4的表达，抑制乳腺癌细胞的侵袭[13]。本课题组通过生物信息检索发现SOX4基因为miR-218的潜在作用位点，并在用miR-218mimic干预HTR-8细胞后，细胞中Sox4的表达减少。之后我们进一步通过荧光素酶素试验发现miR-218可以与Sox4的3'-UTR靶向结合，从而减少Sox4的表达。鉴于Sox4在细胞迁移侵袭中的重要性，我们进一步用Sox4过表达质粒转染HTR-8细胞，发现Sox4过表达质粒的转染可以逆转miR-218抑制HTR-8细胞迁移侵袭的作用。以上实验结果提示miR-218是通过下调Sox4的表达，从而发挥抑制HTR-8细胞迁移侵袭的作用。这也是首次发现miR-128可以通过抑制Sox4发挥抗癌作用，为miR-218在肿瘤治疗中的应用提供思路。

本实验在发现miR-218在HDCP患者血清中表达降低的基础上，进一步通过体外细胞实验，发现miR-218可以抑制HTR-8细胞的迁移侵袭，并进一步通过萤光素酶和转染过表达SOX4质粒的方法证明其机制是通过靶向抑制SOX4的表达，进一步阐明miR-218在HDCP发病机制中的作用，为HDCP的诊治提供新的思路。

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MiR-218 inhibits HTR-8 cells migration and invasion by targeting SOX4

CHEN Yu-juan1△, WU Pei-yang2, GAO Rui-qiu1

(1. Department of Obstetrics, Maternal and Child Hospital of Xiamen City, Xiamen 361000; 2.Department of Medical,the First Affiliated Hospital of Xiamen University, Xiamen 361000, China)

Objective: To verify whether miR-218 could inhibit human trophoblastic cell (HTR-8 cells) migration and invasion by targeting sex determining region Y-box 4(SOX4). Methods: The serum samples were collected from 46 hypertensive disorder complicating pregnancy (HDCP) and 50 normal pregnant women. RT-PCR was used to test the expression of miR-218 in the serum. In vitro, MiR-218 was transfected into HTR-8 cells. The HTR-8 cells were divided into three groups: normal control group, mimic control and miR-218 mimic group. The migratory and invasion ability of HTR-8 cells was tested, and the expressions of matrix metalloproteinase-2(MMP-2), MMP-9 and Sox4 were also investigated in the cells of each group. Luciferase assay was used to confirme whether Sox4-3'-UTR was the target gene of miR-218． Results: The expression of miR-218 was decreased in the serum of HDCP patients compared with the normal pregnant woman(P<0.01).Invitro, compared with the control group, the invasion and migration ability of HTR-8 cells and the expression of MMP-2 MMP-9 and SOX4 were decreased in the miR-218 group (P<0.01); The Luciferase activity of the SOX4-3'-UTR plasmid was significantly suppressed by miR-218 (P<0.01); Over expression of SOX4 could reverse the effect of miR-218 on HTR-8 cells(P<0.01). Conclusion: The expression of miR-218 decreases in the serum of HDPC patients and miR-218 inhibits HTR-8 cells invasion by targeting SOX4-3'-UTR.

hypertensive disorder complicating pregnancy(HDCP); miR-218; sex determining region Y-box 4; trophoblast cell; invasion

国家自然科学青年基金(U1204801)

2016-05-05

2016-12-09

R714.252

A

1000-6834(2017)02-169-06

△【通讯作者】Tel： 13950092828; E-mail: chenyujuanfzxm@sina.com