RNAi干扰Stat3基因诱导喉癌顺铂耐药细胞凋亡及对Stat3信号转导的影响

郭 慧,高 伟,秦 多，李晓明

(1.大连大学附属新华医院 耳鼻喉科，辽宁 大连116021；2.解放军白求恩国际和平医院 耳鼻咽喉头颈外科全军耳鼻咽喉头颈外科中心)

*通讯作者

RNAi干扰Stat3基因诱导喉癌顺铂耐药细胞凋亡及对Stat3信号转导的影响

郭 慧1,高 伟1,秦 多1，李晓明2*

(1.大连大学附属新华医院 耳鼻喉科，辽宁 大连116021；2.解放军白求恩国际和平医院 耳鼻咽喉头颈外科全军耳鼻咽喉头颈外科中心)

目的 利用RNA干扰Stat3基因，探讨其对喉癌细胞系Hep-2细胞中对顺铂耐药的细胞凋亡的影响。方法 常规体外培养人喉鳞状细胞癌hep-2细胞株，重建质粒(pGPU6/GFP/Neo-sh Stat3 、 简称pG/G/N-sh Stat3)通过脂质体包裹转染Hep-2细胞，实验分为：Ⅰ 重建质粒(pG/G/N-sh Stat3)+顺铂(DDP)组；Ⅱ 单纯重建质粒(pG/G/N-sh Stat3)组； Ⅲ 单纯顺铂(DDP)组； Ⅳ 脂质体组； Ⅴ 阴性对照组。利用流式细胞技术检测各试验组转染24 h、48 h及72 h后的细胞凋亡情况，及各试验组转染72h 后Stat3、p- Stat3及其靶目标基因产物Bcl-2蛋白表达水平。 结果 重建质粒(pG/G/N-sh Stat3)增强了顺铂对Hep-2细胞凋亡的促进作用；转染72 h后，流式细胞仪检测结果显示重建质粒(pG/G/N-sh Stat3)+顺铂组的Stat3信号转导通路蛋白Stat3、p- Stat3蛋白及其靶目标基因产物Bcl-2蛋白的表达受到明显的抑制。结论 RNAi沉默STAT3基因通过抑制Stat3相关调控蛋白的表达，诱导喉癌顺铂耐药细胞凋亡，增强人喉鳞状细胞癌hep-2细胞株对化疗的敏感性。

STAT3-siRNA；喉癌；RNA干扰；化疗；凋亡

(ChinJLabDiagn,2017,21:0873)

目前，针对头颈部鳞癌(Head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)生长快速、恶性度高、转移侵袭力强的特点，临床上常采用手术联合放疗和顺铂(DDP)、长春新碱(VCR) 类 、氟尿嘧啶(5-Fu) 等在内的化疗的治疗方式。伴随着化疗的推广，肿瘤化疗耐药，即癌肿对化疗药物的敏感度减低成为困扰医患的的又一难题，其中顺铂(DDP) 耐药尤为显著。

癌症分子靶向治疗的应用日益普遍，它主要针对确定的致癌位点和重要的信号传导通路，设计相关药物，从分子水平逆转并切断肿瘤细胞的恶性行为，使癌症细胞特异性消失[1]。资料显示，Stat3基因高表达于头颈部鳞状细胞癌中， Stat3基因影响了肿瘤的发生和成长，并且还参与了肿瘤迁移、侵袭、血管增生和免疫逃逸等相关现象，被定义为癌基因[2]。研究表明，Stat3的大剂量的持续激活与化疗药物耐药性关系密切[3]。因此，我们以Stat3为靶目标，通过RNAi沉默Stat3基因诱发喉癌中顺铂耐药细胞程序性死亡 ，并研究其对Stat3信号传导通路相关调控蛋白的影响。

我们的前期工作已经发现，利用RNAi沉默Stat3基因可以提高放疗疗效，下调Stat3基因可以在体外引起喉癌顺铂耐药细胞发生凋亡，从而提高恶性肿瘤细胞对各种化疗药物的敏感性[4]。

本实验通过RNAi沉默Stat3基因表达，研究Stat3基因的靶向抑制与化疗耐药之间的关系。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人鳞状喉癌细胞株hep-2细胞株购于上海吉玛公司，在完全RPMI medium 1640培养基中培养 (含链霉素100 μg/ml，10%小牛血清，青霉素100 u/ml)。MTT为invitrogen corporation公司产品。脂质体Lipofectamine 2000 由Sigma公司生产，质粒提取试剂盒购买于美国Promega公司，Stat3、p- Stat3、Bcl-xl鼠抗人单克隆抗体购买于Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 方法研究

1.2.1 重建质粒设计与构建 前期工作成功设计与合成并提纯出重建质粒pGPU6/GFP/Neo-sh Stat3(pG/G/N-sh Stat3),DNA测序鉴定成功。

1.2.2 实验分组与细胞转染 常规培养Hep-2细胞， 生长于培养瓶，细胞融合至40%-60%时实验分组：Ⅰ 重建质粒(pG/G/N-sh Stat3)+顺铂(DDP)组；Ⅱ 重建质粒(pG/G/N-sh Stat3)组； Ⅲ 单纯顺铂(DDP)组； Ⅳ 脂质体组(Liposome)； Ⅴ 阴性对照组(Control)进行转染。于荧光显微镜下观察Hep-2细胞转染率。

1.2.3 细胞凋亡检测 利用脂质体转染喉癌细胞后，细胞继续培养16-24 h，然后依次将上述5组成功转染的喉癌细胞制成单细胞混悬液， PBS处理，在70%冰乙醇中固定，37℃水浴1h， 4℃染色1 h，上流式细胞仪进行测定。

1.2.4 流式细胞仪检测蛋白的表达

转染24、48、72 h后，用胰酶消化各组实验细胞，然后将细胞制成混悬液，无血清状态下继续培育细胞16-24 h， PBS处理，固定于4%多聚甲醛中，冰浴避光40 min，离心5 min， 倒掉上清； PBS清洗，离心，常温固定； 然后用1 ml(5%血清+0.2% Trion-X 100)培养液重悬，继续冰浴、 离心，依次加入Stat3、p- Stat3、 Bcl-xl鼠抗人单克隆抗体相对应的一抗； 冰浴10min后，离心、 清洗，加入二抗； 避光冰浴、清洗、离心后，重悬细胞流式细胞仪检测。

1.3 统计学方法 全部数据采用SPSS 10.0统计软件。计量资料数据比较使用方差分析、t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 重建质粒(pG/G/N-sh Stat3)增加了顺铂对Hep-2细胞凋亡的促进作用 脂质体转染喉癌细胞72 h后，pG/G/N-sh Stat3 +DDP组细胞凋亡率(33.71±1.96%)最高，与 pG/G/N-sh Stat3组、顺铂组、脂质体组、阴性对照组相比均有明显的统计学差异(P<0.05)，Hep-2细胞经过重建质粒转染及顺铂处理后随着时间的增加细胞凋亡率呈上升趋势， 48 h后上升延缓。重建质粒转染及顺铂处理后喉癌细胞凋亡率和增值抑制率明显增加。(见图1,2)

2.2 重建质粒pG/G/N-sh Stat3与顺铂对Stat3信号传导通路相关调控蛋白表达影响 喉癌Hep-2细胞被重建质粒pG/G/N-sh Stat3和顺铂联合反应72 h后，Stat3、p- Stat3蛋白活性与表达下降，其靶目标基因产物Bcl-2蛋白表达下降。经两样本均数方差比较分析，pG/G/N-sh Stat3加顺铂组Stat3、p- Stat3、Bcl-2的蛋白表达荧光指数(1.331±0.221，1.253±0.185，1.236±0.209)大大低于另外四组，差异明显，具有统计学意义(P<0.05)。经Pearson检验分析，治疗各组之间p- Stat3与Bcl-2蛋白表达无明显相关性(r=-0.074,P>0.05)。(见图3～5，表1)

a:阴性对照组l;b:脂质体组;c:顺铂组;d:pG/G/N-sh Stat3;e:pG/G/N-sh Stat3+顺铂)

图2 重建质粒转染及顺铂处理后喉癌细胞凋亡率和增值抑制率及增值指数的比较

a:阴性对照组l;b:脂质体组;c:顺铂组;d:pG/G/N-sh Stat3;e:pG/G/N-sh Stat3+顺铂

2.3 pG/G/N-sh Stat3与顺铂对Stat3 mRNA的表达影响 转染72 h后，pG/G/N-sh Stat3加顺铂组Stat3 mRNA表达明显减弱，两两比较发现pG/G/N-sh Stat3加顺铂组Stat3 mRNA(Stat3/β-actin)光密度比值(0.243±0.904)显著低于顺铂组、脂质体对照组及阴性对照组(P<0.05)，脂质体对照组和阴性对照组无明显差异(P>0.05)。β-actin表达在各组之间无明显差异(P>0.05)。(见图6)

a:阴性对照组l;b:脂质体组;c:顺铂组;d:pG/G/N-sh Stat3;e:pG/G/N-sh Stat3+顺铂

a:阴性对照组l;b:脂质体组;c:顺铂组;d:pG/G/N-sh Stat3;e:pG/G/N-sh Stat3+顺铂

表1 重建质粒转染及顺铂作用喉癌细胞72 h后Stat3,p- Stat3,Bcl-2Bcl-2蛋白的表达

＊和阴性对照组比较,＊P<0.05;△和顺铂组比较,△P<0.05

精准医疗时代，化疗与其他治疗手段联合发挥着独特的作用，其中以顺铂为根本的化疗方案广泛应用于各种恶性肿瘤的治疗，其中包括喉鳞状细胞癌。临床上之所以采用联合用药，主要目的是为了减少只用一种药物而引起的肿瘤耐药作用，增强癌肿细胞对化疗药物的灵敏度，减低耐药细胞复制，尽可能的杀伤肿瘤细胞。为了减少肿瘤耐药，多使用化疗增敏剂，化疗增敏剂又叫耐药逆转剂，是指化疗药物与少许剂量的该化学物质联合应用可以提高化疗疗效[5]。常用的化疗增敏剂主要有基因制剂、多药耐药(Multidrug Resistance MDR)逆转剂、中药及其提取物、乏氧细胞杀伤剂、其他药物。

a:阴性对照组l;b:脂质体组;c:顺铂组;d:pG/G/N-sh Stat3;e:pG/G/N-sh Stat3+顺铂

顺铂治疗喉癌的主要机理是与喉鳞癌细胞的DNA分子组成链内、外交叉联，和DNA蛋白质交联，导致DNA分子受损，引起细胞程序性死亡[6]。

癌瘤细胞的DNA损伤修复系统，是导致以顺铂为代表的喉鳞癌化疗耐药的因素之一，主要原因是，顺铂与核蛋白连接后，形成了顺铂与DNA链内或链间的交联、DNA-蛋白质之间的交联受到损坏， 在促分裂原的帮助下DNA损伤信号激活p73、p53、蛋白激酶等多种信号传导途径，进一步激活凋亡信号，最终导致肿瘤细胞凋亡受到抑制。而跨膜受体酪氨酸蛋白激酶(Tyrosine protein kinase,TPK)家族成员可通过JAK途径或直接磷酸化Stat3蛋白，引起EGFR-STAT3信号转导通路，假如可以抑制这一途径，就可以抑制激活凋亡信号，阻止喉癌细胞凋亡受到抑制。本次实验就是通过重建质粒(pG/G/N-sh Stat3)抑制Stat3信号传导通路相关调控蛋白，从而抑制激活凋亡信号，防止喉癌细胞凋亡受到抑制。

此次实验中，我们观察到重建质粒(pG/G/N-sh Stat3)与顺铂同时作用于Hep-2细胞72 h后，应用流式细胞技术检测到Stat3及p- Stat3蛋白活性与表达下降，同时靶目标基因产物Bcl-2表达明显下调，而其余几组中Stat3及p- Stat3、Bcl-2蛋白无明显改变，说明重建质粒(pG/G/N-sh Stat3)可以起到顺铂化疗增敏剂的作用，抑制Stat3的表达从而起到对顺铂化疗增敏的作用。

肿瘤细胞凋亡机制相当复杂[7]，近期研究发现，癌细胞中Stat3的抗凋亡作用存在有两条途径，分别是Bcl-2依赖途径、Bcl-2非依赖途径。在人骨髓瘤细胞系U266中研究员曾经发现Bcl-2依赖的途径，他们通过大量研究发现持续激活Stat3基因能够诱发抗凋亡基因Bcl-2的高度活化，阻断Stat3信号传导亦可引起癌细胞中Bcl-xl的表达减弱，可以导致细胞大量程序性死亡。

从此次实验中我们观察到：转染重建质粒(pG/G/N-sh Stat3)的细胞因为受到顺铂的影响，其细胞凋亡率比未被重建质粒转染的细胞和单纯顺铂作用的细胞的凋亡率明显升高，说明质粒pG/G/N-sh Stat3可以通过阻止Bcl-2的表达，强化顺铂对Hep-2细胞凋亡的促进作用。而且，从Stat3 RT-PCR表达结果可以看出，同时进行质粒(pG/G/N-sh Stat3)转染和化学治疗细胞中的Stat3 mRNA表达量明显下降，与单纯重建质粒转染组、单纯顺铂治疗组、阴性对照组有明显差异，进一步证明RNAi干扰亦可以从RNA水平上强化顺铂对Stat3基因表达的限制作用。

经过实验我们得出如下结论，质粒(pG/G/N-sh Stat3)可以增强化疗对肿瘤细胞凋亡的诱导，并且还可以强化其对肿瘤细胞生长、 分裂的抑制作用，可以助力化疗，起到化疗增敏剂的效果。进一步验证了阻断Stat3信号传导，能够帮助化疗阻滞喉癌细胞周期、限制细胞生长，增强其对Hep-2细胞凋亡的诱导，从而增强Hep-2细胞对顺铂的敏感性，可以通过不追加化疗药物剂量，而实现增加喉鳞癌细胞化疗疗效。

综上，证实了RNAi干扰技术可以逆转喉鳞癌化疗耐药，其有效性得到肯定，加深了研究者们对化疗耐药机制的了解，为我们在基因水平上改变肿瘤细胞的化疗敏感性提供了线索，为寻找高效、低毒性的基因制剂方面的化疗增敏剂指明了方向。

[1]Peralta-Zaragoza O,Bermudez-Morales VH,Perez-Plasen-cia C,et al.Targeted treatments for cervical cancer:a review [J].Onco Targets Ther,2012,5:315.

[2]Avalle,L,Pensa,S,Novelliu F,et al.STAT1 and STAT3 in tumorigenesis:a matter of balance[J].JAK-STAT,2012,1(2):65.

[3]Ji T,Gong D,Han Z,et al.Abrogation of constitutive Stat3 activity circumvents cisplatin resistant ovarian cancer[J].Cancer Lett,2013,341(2):231.

[4]王俊阁,李晓明,陈英会,等.信号转导及转录活化因子3反义寡核苷酸联合化疗调控喉癌细胞增殖与凋亡的分子机制[J].中华耳鼻咽喉头颈外科杂志,2007,42(3):222.

[5]Limtrakul P.Curcumin as chemosensitizer J[J].Adv Exp Med Biol,2007,595:269-300.

[6]薛惠荣，王丽萍，耿嘉男，等.siRNA沉默HIF-1α基因对人卵巢癌细胞SKOV3/DDP耐药的影响[J].中国实验诊断学，2013，8(17):1045.

[7]Brenner C,Galluzzi L,Kepp O,et al.Decoding cell death signals in liver inflammation[J].J Hepatol ,2013,59(3):583.

RNA interference Stat3 gene induced laryngeal carcinoma cisplatin resistant cell apoptosis of Stat3 signaling pathway

GUOHui,GAOWei,QINDuo,etal.

(DepartmentofOtolaryngolog，XinhuaHospital,Dalian116021,China)

Objective By using RNA interference STAT3 gene,discuss the effect of cell apoptosis for cisplatin resistance in the hep-2 cell (laryngeal squamous cell carcinoma cell) .Methods In vitro cultivation the hep-2 cell (laryngeal squamous cell carcinomacell) ,reconstruct plasmid (pGPU6/GFP/Neo-sh Stat3,hereinafter referred to as pG/G/N-sh Stat3) by liposome transfection package hep- 2 cells,the experiment is divided into:Ⅰ reconstruction plasmid (pG/G/N-sh Stat3) + cisplatin (DDP) group;Ⅱ pure reconstruction plasmid (pG/G/N-sh Stat3) group;Ⅲ pure cisplatin (DDP) group;Ⅳ liposome group;Ⅴ negative control group.By using Flow cytometry technology to detect apoptosis of cell of different experimental transfection 24 h,48 h and 72 h,and protein expression levels of Stat3,p-Stat3 and its target gene product the Bcl-xl of different experimental transfection after 72 h.Results Reconstruction plasmid (pG/G/N-sh Stat3) enhances the promoting role of cell apoptosis by DDP in Hep-2 cell,After transfection of 72 h,flow cytometry showed that the expression was significantly inhibited of the STAT3 signal transduction pathway related protein in the reconstruction plasmid (pG/G/N-sh Stat3) + cisplatin (DDP) group.Conclusion By inhibiting the expression of STAT3 related regulatory proteins,RNAi STAT3 gene silence apoptosis induction of laryngeal cancer cisplatin resistance,increase chemotherapy sensitivity of the hep-2 cell (laryngeal squamous cell carcinoma cell) .

STAT3-siRNA;Laryngeal cancer；RNA interference;Chemotherapy;apoptosis

1007-4287(2017)05-0873-05

R739.65

A

2016-09-12)